本文關鍵詞：1型糖尿病大鼠Nfic與成骨成脂相關基因表達的探究及胰島素的干預作用

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【摘要】：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。機體血糖增高是由于胰島素分泌缺陷、生物作用受損或兩者協(xié)同作用所致。血糖水平增高可導致機體各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害與功能障礙。1型糖尿病(DM1)多發(fā)于兒童和青少年,表現(xiàn)為患者體內胰島素絕對不足,必須依賴外源性胰島素降低血糖。1948年Albright和Reifenstein首次提出了糖尿病型骨質疏松癥(Diabetic Osteoporosis,DOP)這一概念,明確指出糖尿病患者血糖長期控制不良容易發(fā)生骨質疏松。糖尿病型骨質疏松癥是指在糖尿病基礎上并發(fā)骨量減少,骨脆性增加,骨顯微結構受損的全身代謝性骨病。眾所周知,骨組織的改建與成熟主要由骨形成和骨吸收兩個過程不停地循環(huán)交替來完成。研究表明,DM1主要導致骨形成降低。骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)具有成骨分化和成脂分化的能力。成骨分化受到眾多信號通路及相關轉錄調控因子的影響,其中Nfic為核因子I(Nuclear factor-1, Nfi)家族的四個成員之一,過表達的Nfic可促使成骨細胞分化增加,新骨形成。此外,Nfic也可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的表達,抑制BMSCs的成脂分化,顯示出與年齡及激素水平相關的骨質疏松癥樣的表型。本實驗主要研究：1、1型糖尿病大鼠模型建立及首次建模失敗后的補救措施及其效果；2、糖尿病大鼠模型胰腺組織學改變及模型的穩(wěn)定性；3、1型糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關基因(Runx2、OSX、IGF-1、BMP-2)及成骨特異性標記基因(COL2A1、OC、ALP)的表達狀況；4、1型糖尿病大鼠成脂基因PPARy的表達情況；5、Nfic基因表達變化對成骨相關基因及成脂基因PPARγ表達的影響；6、胰島素對1型糖尿病大鼠Nfic及成骨成脂基因表達的干預作用。第一部分：1型糖尿病大鼠模型的制備、建模失敗后補救措施及胰島素對大鼠模型的治療效果目的研究通過鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導建立1型糖尿病大鼠模型的方法及首次建模失敗后的補救措施及效果,并對胰島素對大鼠模型的干預作用進行初步探究。方法：健康6-8周齡雄性Wistar大鼠30只,隨機分為2組,建模組25只,對照組5只。給予建模組大鼠一次性大劑量腹腔注射STZ(65mg/kg),同時對照組大鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。72h后檢測大鼠的血糖值判斷建模是否成功。首次建模成功的大鼠隨機分為兩組,模型組和治療組。治療組于實驗開始的第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。對首次建模失敗的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周,再次腹腔注射STZ(65mg/kg),并命名為補救組,觀察其成模狀況。分別在建模后第0、2、4、6、8周測量大鼠的體重與血糖并觀察其一般情況。于建模后第8周處死全部大鼠,取胰腺標本進行HE染色和胰島素的免疫組化染色,觀察胰腺組織的病理學改變。結果：1、體重狀況：模型組與補救組大鼠體重降低或保持不變,對照組及治療組大鼠體重增加明顯。2、血糖狀況：建模組有21只大鼠首次注射STZ 72h后,血糖值達到成模標準(隨機血糖值≥16.7mmol/L),4只血糖值未達到成模標準,再次注射STZ72h后血糖值檢測均達到成模標準。在建模成功組中隨機選取20只均分為模型組和治療組。持續(xù)觀察8周,模型組大鼠均成模穩(wěn)定,糖尿病癥狀明顯,未見血糖轉復正常。治療組大鼠胰島素治療后,血糖由高血糖狀態(tài)降為正常水平。對照組大鼠各項指標均未見異常。3、胰腺組織細胞學觀察可見：對照組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則,細胞數(shù)目正常。與對照組相比,模型組、治療組及補救組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則,體積萎縮變小,胰島內分泌細胞數(shù)量明顯減少。補救組與模型組相比,其胰島形態(tài)更不規(guī)則。與模型組相比,治療組胰島體積稍大,內分泌細胞排列更加整齊。4免疫組化觀察：胰島素胰腺免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組和補救組胰島素分布面積顯著減少。補救組與模型組相比,其胰島素分布面積略有增加。治療組胰島素分布面積略大于模型組。結論：一次性大劑量腹腔注射STZ可制備有效、穩(wěn)定的1型糖尿病大鼠模型。首次建模失敗后,適時再次注射STZ仍可制備高質量的1型糖尿病大鼠模型。胰島素治療可使1型糖尿病大鼠保持正常的血糖水平,在一定程度上對胰腺細胞產生治療作用。第二部分：糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關基因表達的探究及胰島素的干預作用目的探究糖尿病大鼠Nfic及成骨相關基因的表達變化及關系,研究胰島素對糖尿病大鼠骨代謝的干預作用。方法 1型糖尿病大鼠模型制作同前,將大鼠分為3組,對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。觀察三組大鼠體重、血糖變化；8周后處死全部大鼠,胰腺組織進行HE染色及胰島素的免疫組化檢測；Q-PCR法檢測雙側股骨Runx2、Osterix (OSX)、Nfic、 COL2A1、OC(骨鈣素)、ALP、BMP-2、IGF-1(胰島素樣生長因子-1)的mRNA表達水平。結果Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),OC、IGF-1、Runx2、OSX基因mRNA表達中,模型組明顯低于對照組與治療組,治療組與對照組無顯著差異。COL2A1基因的mRNA表達中,模型組明顯低于對照組與治療組(p0.001,p0.01),治療組的表達量顯著低于對照組(p0.05)。ALP基因的mRNA表達中,模型組及治療組均顯著高于對照組(p0.01),模型組較治療組偏低,但無顯著性差異(p0.05)。BMP-2、Nfic基因的nRNA表達中,模型組與治療組顯著低于對照組(p0.05,p0.05)。模型組與治療組之間無顯著性差異(p0.05)。結論在1型糖尿病大鼠模型中,骨組織Runx2、Nfic、OSX、BMP-2、IGF-1、OC、 COL2A1 mRNA表達水平顯著下降,ALP mRNA表達水平顯著升高,胰島素的應用可逆轉Runx2、OSX、IGF-1、OC、COL2A1 mRNA表達的下降,促進骨形成。第三部分糖尿病大鼠Nfic與成脂基因PPARy的表達的變化及胰島素的干預作用目的研究糖尿病大鼠中Nfic、PPARy基因mRNA的表達變化及胰島素對Nfic、 PPARy基因mRNA表達的干預作用。方法1型糖尿病大鼠模型制作同前,將大鼠分為3組,對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。模型建成后8周處死全部大鼠,Q-PCR法檢測雙側股骨Nfic、PPARγ的nRNA表達水平。結果Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在Nfic基因的mRNA表達中,與對照組相比,模型組和治療組均顯著減少(p0.1)(p0.001);治療組與模型組相比,無顯著性差異。在PPARγ基因mRNA的表達中,與對照組相比,模型組和治療組均顯著增加(p0.001)(p0.5);治療組與模型組相比,顯著減少(p0.001)。結論:1型糖尿病大鼠Nfic基因mRNA表達水平下降可提高PPARγ基因mRNA的表達水平,從而促進脂肪的形成。胰島素的干預不能完全扭轉成骨轉錄因子Nfic的減少及成脂基因PPARγ的增加。
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

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