本文關(guān)鍵詞：LATs在類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:1探討LAT1和LAT3在類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞中的功能和機(jī)制。2探討LAT1和LAT3在類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。方法:1采用qRT-PCR的方法檢測LATs在滑膜組織中的表達(dá);設(shè)計(jì)合成LAT1和LAT3的siRNA;分離培養(yǎng)原代滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLS);siRNA沉默RA FLS中LAT1和LAT3的表達(dá);qRT-PCR和Western Blot檢測沉默效率;采用MTS法和Transwell法檢測沉默LAT1和LAT3后RA FLS的增殖和侵襲能力;采用[~~3H]-L-leucine吸收實(shí)驗(yàn)檢測沉默LAT1/LAT3和LATs抑制劑BCH對(duì)RA FLS亮氨酸吸收的影響;采用qRT-PCR的方法檢測沉默LAT1/LAT3和LATs抑制劑BCH對(duì)RA FLS中MMPs表達(dá)的影響;采用Western Blot的方法檢測LATs的抑制劑BCH對(duì)RA FLS中mTOR和P70S6K活性的影響。2采用炎性因子IL-17、TNF-α和LPS刺激RA FLS,并用qRT-PCR的方法檢測LAT1和LAT3在m RNA水平表達(dá)的變化;采用Transwell法檢測IL-17對(duì)RA FLS侵襲的影響,然后分別檢測LAT1siRNA、LAT3 siRNA和BCH與IL-17協(xié)同作用對(duì)RA FLS侵襲能力的影響;IL-17刺激RA FLS的同時(shí),采用信號(hào)通路抑制劑PDTC、Stattic、Temsirolimus、PD98059分別抑制NF-κB、STAT3、mTOR、MEK信號(hào)通路,用qRT-qPCR的方法檢測LAT1和LAT3,探討通路抑制劑對(duì)IL-17刺激作用的影響。結(jié)果:1在RA滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3三個(gè)LATs家族成員的表達(dá),與OA相比,LAT1和LAT3的表達(dá)明顯升高(***P0.001,*P0.05);si RNA特異性抑制LAT1和LAT3的表達(dá)后,RA FLS中LAT1和LAT3在mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(**P0.01,*P0.05),沉默效率達(dá)70%;MTS法結(jié)果顯示siRNA沉默LAT1和LAT3后,RA FLS的增殖能力無明顯變化(P0.05);Transwell法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA沉默LAT1和LAT3后,RA FLS的侵襲力明顯降低(***P0.001,***P0.001);[~~3H]-Lleucine吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA沉默LAT1和LAT3后,RA FLS對(duì)氨基酸的吸收明顯降低(***P0.001,***P0.001);LATs抑制劑BCH可以明顯降低RA FLS對(duì)[~~3H]-L-leucine的吸收(*P0.05)、明顯減弱RA FLS的侵襲能力(*P0.05),同時(shí)明顯減弱RA FLS中信號(hào)通路分子mTOR的活性。2炎性因子IL-17、LPS、TNF-α刺激RA FLS后,只有IL-17可以顯著提高LAT1和LAT3的表達(dá)水平(***P0.001,***P0.001),并且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性(*P0.05,**P0.01,***P0.001);Transwell法結(jié)果顯示,炎性因子IL-17刺激可以明顯促進(jìn)RA FLS的侵襲(***P0.001),且IL-17對(duì)RA FLS的促侵襲作用可以被LAT1 siRNA、LAT3 siRNA、及LATs抑制劑BCH逆轉(zhuǎn)(**P0.01,***P0.001);在PDTC、Stattic、Temsirolimus、PD98059四種通路抑制劑中,mTOR信號(hào)通路抑制劑Temsirolimus可以明顯逆轉(zhuǎn)炎性因子IL-17對(duì)LAT1的上調(diào),而NF-κB抑制劑PDTC可以逆轉(zhuǎn)IL-17對(duì)LAT3的上調(diào)(***P0.001)。結(jié)論:1 RA滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3的表達(dá),與OA相比,LAT1和LAT3的表達(dá)明顯升高,并且LAT1和LAT3可能通過影響氨基酸的吸收來影響mTOR的活性,進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲。2炎性因子IL-17通過mTOR信號(hào)通路上調(diào)LAT1的表達(dá),通過NF-κB信號(hào)通路上調(diào)LAT3的表達(dá),并且其上調(diào)作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性;LAT1和LAT3可介導(dǎo)IL-17對(duì)RA FLS的促侵襲作用。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙瑜;王林;潘繼紅;;miRNA在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2015年09期

2 杜s，

本文編號(hào)：1282452