本文關鍵詞：人GJB6基因突變對HaCaT細胞增殖與凋亡的影響和機制

  更多相關文章： 有汗性外胚葉發(fā)育不良 縫隙連接蛋白 Tet-on HaCaT細胞 凋亡

【摘要】：目的有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia, HED)是一種常染色體顯性外胚葉發(fā)育不良疾病。當編碼Cx30縫隙連接蛋白的GJB6基因發(fā)生突變時,可引起耳聾和有汗性外胚葉發(fā)育不良。本研究中,以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達GJB6基因及其突變體的HaCaT細胞株,進一步了解GJB6基因突變引起HaCaT細胞凋亡的機制,初步探究GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機制。方法利用PCR技術擴增人GJB6基因野生型與突變型(A88V、G11R)基因,重組Tet-on'慢病毒質粒,經(jīng)基因測序及酶切技術對其鑒定,再將重組慢病毒轉染入HaCaT細胞,經(jīng)puromycin篩選出穩(wěn)定表達編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細胞株。細胞株加四環(huán)素(DOX)誘導后,通過RT-PCR檢測GJB6基因的mRNA表達量,同時通過Western blot檢測Cx30的表達,從而對穩(wěn)定表達GJB6基因的HaCaT細胞株進行鑒定。用CCK8法檢測GJB6基因野生型與突變型經(jīng)DOX誘導表達后對細胞增殖的影響。利用流式細胞分析法檢測加DOX誘導基因表達后對HaCaT細胞凋亡的影響。通過Western blot檢測HED相關臨床表型指標和相關凋亡指標的蛋白水平的變化。結果經(jīng)酶切、測序鑒定重組慢病毒質粒構建成功。RT-PCR檢測到穩(wěn)定轉染的HaCaT細胞中GJB6基因的mRNA表達量明顯增加,WT(加四環(huán)素)組GJB6基因表達豐度是WT(不加四環(huán)素)組的113.369倍(P0.05)； A88V(加四環(huán)素)組GJB6基因表達豐度是A88V(不加四環(huán)素)組的3.249倍(P0.05)；G11R(加四環(huán)素)組GJB6基因表達豐度是G11R(不加四環(huán)素)組的32.011倍(P0.05)；Western blot可檢測到經(jīng)DOX處理的WT組和A88V組、G11R組穩(wěn)定表達Cx30,而未經(jīng)DOX處理的細胞和NC組細胞未檢測到Cx30目的條帶。NC組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值無統(tǒng)計學差異；WT組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在以下時間節(jié)點(4、8、12、24、36 h)吸光度值存在統(tǒng)計學差異；A88V組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在統(tǒng)計學差異；G11R組：加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48 h)吸光度值均存在統(tǒng)計學差異。流式細胞分析法檢測到相比NC組、WT組,A88V、G11R組明顯降低了細胞的增值率,導致HaCaT細胞的凋亡,經(jīng)統(tǒng)計分析,P0.05。加入四環(huán)素誘導后,GJB6基因突變型A88V.G11R可引起內披蛋白表達量降低,絲聚蛋白、角蛋白K6b、兜甲蛋白表達量無明顯變化。凋亡指標Bcl-2、Bax的表達量無明顯改變；Caspase 3、Caspase8、Caspase9、 PARP等凋亡相關指標可見其剪切體。結論成功構建出穩(wěn)定表達GJB6基因野生型及其突變體A88V.G11R的HaCaT細胞株,進一步探究了突變型A88V、G11R導致HaCaT細胞凋亡的可能機制,初步了解GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機制,為下一步研究其發(fā)病機制奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R596.1

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 Ferrara F.;Amato C.;張劍萍;;亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變導致卵巢過度刺激綜合征1例[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(婦產(chǎn)科學分冊);2005年11期

2 Combi R;Dalprà L.;Ferini-Strambi L.;Tenchini M.L;袁海峰;;額葉癲癇與促腎上腺皮質激素釋放激素基因突變的關系[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(神經(jīng)病學分冊);2006年05期

3 智剛;蘇成芝;;基因突變帶來的啟示[J];醫(yī)學與哲學;1991年02期

4 潘宏銘;宋修山;;人群基因突變的檢測[J];浙江醫(yī)學情報;1995年02期

5 劉廣志;新確定的基因與癡呆有聯(lián)系[J];英國醫(yī)學雜志(中文版);2000年03期

6 姚華,王國荃;砷與基因關系的研究進展[J];地方病通報;2001年01期

7 張?zhí)K明,劉小紅,倪黎,金慶文,郭慶榮,宮道華;急性淋巴細胞性白血病與P~(53)基因突變的相關性研究[J];實用兒科臨床雜志;2002年05期

8 龐慶豐,郭冬平,李曉,陳琪,范樂明;一個新的低密度脂蛋白受體基因突變位點[J];中華醫(yī)學雜志;2003年05期

9 黃琰,李若葆;吸煙與肺癌基因突變的關系[J];濰坊醫(yī)學院學報;2004年02期

10 易彥;張廣森;;非肌性肌球蛋白重鏈9基因突變相關疾病[J];國外醫(yī)學.輸血及血液學分冊;2005年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳競生;徐修才;周榮富;方怡;王學鋒;翟志敏;王鴻利;;β鏈基因突變引起一例遺傳性無纖維蛋白原血癥[A];中華醫(yī)學會第八次全國血液學學術會議論文匯編[C];2004年

2 劉艷;雷小兵;彭振輝;肖生祥;王俊民;周欣;耿松梅;李政宵;;先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病1家系的基因突變研究[A];2006中國中西醫(yī)結合皮膚性病學術會議論文匯編[C];2006年

3 肖生祥;劉艷;雷小兵;彭振輝;王俊民;周欣;耿松梅;李政宵;;先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病1家系的基因突變研究[A];中華醫(yī)學會第十二次全國皮膚性病學術會議論文集[C];2006年

4 馬紹剛;方佩華;呂枚;許靜;李寧;陳慧;馮潔;;先天性甲狀腺功能減退癥基因突變研究[A];天津市核學會2005年學術交流會論文匯編[C];2005年

5 楊芳;金佩佩;王學鋒;李薇;丁秋蘭;王冠軍;王鴻利;;2例新的基因突變導致遺傳性蛋白S缺陷癥[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

6 王貴;裘衛(wèi)東;;基因在疼痛與鎮(zhèn)痛中的影響[A];浙江省醫(yī)學會疼痛學分會成立大會暨首屆浙江省醫(yī)學會疼痛學分會學術年會論文匯編[C];2011年

7 孟巖;張續(xù)德;施惠平;趙時敏;姚鳳霞;蘇亮;黃尚志;;顱額鼻綜合征的基因突變研究[A];第八次全國醫(yī)學遺傳學學術會議(中華醫(yī)學會2009年醫(yī)學遺傳學年會)論文摘要匯編[C];2009年

8 曹林枝;;P53基因及其分子生物學作用[A];廣西生物化學與分子生物學會第六次學術研討會論文摘要[C];2003年

9 吳雪瓊;張俊仙;李洪敏;梁建琴;鐘敏;王巍;;結核分支桿菌耐藥基因的研究[A];中國防癆協(xié)會全國學術會議大會學術報告[C];2001年

10 楊芳;金佩佩;王學鋒;丁秋蘭;王鴻利;李薇;王冠軍;;2例新的基因突變導致遺傳性蛋白S缺陷癥[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 報道員 周谷風;基因突變是好是壞[N];新華每日電訊;2010年

2 孫浩;基因檢測：為防病摘除還健康的器官？[N];新華每日電訊;2006年

3 張民;英展開癌癥相關基因突變測定研究[N];中國醫(yī)藥報;2007年

4 本報記者 李禾;吸煙導致的基因突變可代代相傳？[N];科技日報;2010年

5 醫(yī)學博士 科學松鼠會成員 致樺;基因檢測是與非[N];中國經(jīng)營報;2010年

6 本報記者 王丹;天賦基因檢測：預測未來還是娛樂大眾[N];健康報;2010年

7 江蘇省中醫(yī)院轉化醫(yī)學中心 賴仁勝;基因檢測放任自流態(tài)勢需扭轉[N];健康報;2011年

8 本報實習記者 楊璇;“基因保存”服務沒價值[N];北京科技報;2010年

9 實習生 劉冰玉;檢測癌癥基因能否一紙完成？[N];科技日報;2012年

10 記者 耿建擴 通訊員 李晉陶 程益聰;人類8種新發(fā)基因突變被發(fā)現(xiàn)[N];光明日報;2013年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 肖珊;維吾爾族2型糖尿病相關基因的多態(tài)性及基因—基因、基因—環(huán)境交互作用研究[D];新疆醫(yī)科大學;2015年

2 于韶榮;惡性腫瘤患者血漿KRAS基因突變檢測[D];南京大學;2011年

3 楊琳;晚期非小細胞肺癌EGFR基因突變狀態(tài)的血清多肽質譜研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2016年

4 馬亞琳;非綜合征型耳聾患者基因突變熱點篩查及一個耳聾家系MYO7A基因新突變分析[D];山東大學;2016年

5 崔亞娟;第一部分 慢性中性粒細胞白血病臨床特征及基因突變的研究 第二部分 慢性粒單核細胞白血病基因突變的研究及預后意義[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

6 馮磊;基于臨床生化指標的冠心病預測模型建立及其與基因易感性關聯(lián)的探索研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

7 金佩佩;遺傳性FⅫ缺陷癥分子機制及血小板相關疾病研究[D];上海交通大學;2015年

8 茅江峰;不同基因突變對特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥患者的臨床特點、隱睪和生精療效的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

9 楊昭慶;云南省兩種遺傳性血液疾病的基因突變研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2001年

10 李冰;第一部分 原發(fā)性骨髓纖維化患者基因突變的研究 第二部分 原發(fā)性骨髓纖維化患者的細胞遺傳學研究 第三部分 血清鐵蛋白是中國骨髓增生異常綜合征中危-1組患者的獨立預后因素[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李娟;Fabry病GLA基因變異與臨床表現(xiàn)的相關研究[D];石河子大學;2015年

2 楊浩;Peutz-Jeghers綜合征的STK11基因突變研究[D];川北醫(yī)學院;2015年

3 周雙才;非小細胞肺癌EGFR基因突變狀態(tài)與中醫(yī)體質的相關性研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2015年

4 王慶泊;胃腸道間質瘤c-kit基因檢測臨床意義的研究（附119例分析）[D];河北醫(yī)科大學;2015年

5 錢曉燕;EGFR及KRAS基因突變臨床檢測方法學比較及其影響因素分析[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

6 顧棚;偶蹄目TLR1-4基因的分子進化研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 王薇;ARVC患者和正常人群橋�；蛲蛔兗癝NP比較研究[D];南京醫(yī)科大學;2013年

8 郭秀;92例骨髓增殖性腫瘤JAK2V617F基因的檢測及其臨床意義[D];大連醫(yī)科大學;2015年

9 蔡浩;青海晚期NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)與臨床病理特征及療效的關系[D];青海大學;2016年

10 陳興旺;TTR基因突變c.-743A＞T對該基因表達的影響[D];遵義醫(yī)學院;2016年

，

本文編號：1259066