本文關鍵詞：胚胎期及出生早期脂多糖暴露對小鼠骨骼發(fā)育和成年期骨穩(wěn)態(tài)的影響

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【摘要】：骨骼系統(tǒng)是由骨組織和骨髓共同構成。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn),骨骼除了具有運動、保護內臟器官、支撐人體、參與調節(jié)鈣磷代謝等基本功能外,還是一個多功能器官,參與多種生理、病理過程并發(fā)揮重要作用。在骨髓微環(huán)境中,造血干細胞生成各種血液細胞,成骨細胞與破骨細胞影響造血干細胞的生成和動員,此外,骨骼還能夠像內分泌器官一樣產生多種激素、生長因子及細胞因子,由此可見骨骼系統(tǒng)的重要性,骨骼通過與其他器官、系統(tǒng)協(xié)同作用,維持人體正常的生理活動。骨骼上述重要功能的發(fā)揮依賴于骨骼穩(wěn)態(tài)的維持。成骨細胞介導的骨形成及破骨細胞介導的骨吸收相互耦聯(lián)調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)平衡。當骨形成減少或骨吸收增加均可導致骨質疏松發(fā)生。骨質疏松(osteoporosis)是一種以骨強度降低為主要表現(xiàn)的慢性代謝性骨骼疾病,隨著我國人口老齡化的趨勢,骨質疏松的發(fā)病率也逐年增加,現(xiàn)已成為嚴重影響我國老年人健康的高發(fā)病。骨質疏松可導致骨折風險增加,其中最嚴重的并發(fā)癥---髖部骨折,其致死、致殘率高。然而骨質疏松的發(fā)生機制尚未完全闡明,吸煙、飲酒、絕經、遺傳等因素都與其發(fā)病相關。健康和疾病的發(fā)育起源(The developmental origins of health and disease,DOHa D)假說認為人類在發(fā)育過程的早期(包括胎兒、嬰兒、幼兒時期)接受的多種不利因素(如藥物、酒精、營養(yǎng)不良、缺氧、炎癥等)可影響包括骨質疏松、糖脂代謝、哮喘、腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、精神神經系統(tǒng)疾病等在內的多種成年期慢性非傳染性疾病(non-communicable diseases,NCDs)的發(fā)生、發(fā)展。但生命早期(孕期和產后早期)不利因素的刺激對骨骼發(fā)育及其成年期骨穩(wěn)態(tài)的具體作用及其可能的機制尚不清楚。明確這點有助于揭示骨質疏松新的發(fā)病機制,并從更廣泛的意義闡明生命早期不利因素刺激與成年期慢性非傳染性疾病的發(fā)育起源的關系。炎癥因素是臨床上個體發(fā)育過程的早期接受的常見不利因素之一,如孕期的牙齦感染、上呼吸道感染、宮內感染等。此外,嬰幼兒時期的個體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟,抵抗力差,炎性疾病的發(fā)病率較高。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏染色陰性細菌外膜的主要成分,存在于多種病原菌中,可導致炎癥的發(fā)生。因此本研究以LPS為致炎因子處理骨組織或動物模型,觀察胚胎期及出生早期炎癥因素刺激對骨骼發(fā)育及成年期骨穩(wěn)態(tài)的影響。目的:利用胚胎期及出生后早期LPS刺激模型,檢測生長板長度、體格參數(shù)、骨量、破骨細胞活性、成骨細胞及破骨細胞相關基因m RNA表達情況等指標以明確生命早期炎癥因素對骨骼發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)的影響。方法:第一部分:1.分離E18.5 d小鼠跖骨和脛骨,分為對照組及LPS組,LPS組以10μg/m L LPS(0111:B4)處理7d。2.第1、7天測量跖骨和脛骨全長及礦化帶長度,計算跖骨和脛骨全長增長率(TL-rate)、礦化帶增長率(CZ-rate)、第7天礦化帶占骨全長的比例(CZ%)。3.培養(yǎng)7d后標本取材,臧紅固綠、甲苯胺藍染色觀察肥大帶寬度;Ⅱ型膠原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型膠原(collagenⅩ,ColⅩ)免疫組化染色觀察軟骨細胞分化;TUNEL染色觀察軟骨細胞凋亡。4.C57小鼠分為LPS組和對照組,于E15.5腹腔注射LPS(0111:B4)25ug/kg,或等劑量生理鹽水,子代小鼠2m、4m及8m取材。5.小鼠宏觀表型觀察:體重、尾長。6.整體X光、離體股骨X光、離體股骨Micro-CT掃描檢測小鼠骨量變化。7.臧紅固綠染色測量生長板厚度、HE染色觀察骨小梁、TRAP染色觀察破骨細胞活性。8.定量PCR檢測股骨組織成骨相關基因(OP、OC)及破骨相關基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)的表達。第二部分:1.出生后5d的C57小鼠分為LPS組和對照組,LPS組腹腔注射LPS(0111:B4)2mg/kg,對照組腹腔注射等劑量生理鹽水,2m、4m及8m取材。2.同第一部分5~8。結果:第一部分:1.與對照組比較,LPS處理后跖骨和脛骨TL-rate及CZ-rate明顯降低(跖骨TL-rate P=0.025);(跖骨CZ-rate P=0.019);(脛骨TL-rate P=0.010);(脛骨CZ-rate P=0.024)。LPS組脛骨肥大帶較對照組明顯變短(P0.001)。與對照組比較,LPS組脛骨的軟骨分化相關蛋白CoⅡ、ColⅩ表達降低,軟骨細胞凋亡明顯增加。2.胚胎期LPS暴露小鼠身出生后身長變短、體重下降(P0.05)。3.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期骨密度較對照小鼠降低。Micro-CT發(fā)現(xiàn)與同齡對照組小鼠比較,LPS組小鼠骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N減少(P0.05)、Tb.Th減少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),骨皮質BV/TV下降(P0.05)、C.Th減少(P0.05)。4.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期生長板窄于同齡對照組小鼠(P0.05),且其骨小梁稀疏,反映破骨細胞功能的指標Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于對照組(P0.05)。。5.胚胎期LPS暴露的小鼠成年期成骨(OP、OC)相關基因表達降低(P0.05)、破骨相關基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表達增高(P0.05)。第二部分:1.出生早期LPS刺激的小鼠身長、體重均明顯低于對照組(P0.05)。2.出生早期LPS刺激的小鼠2m、4m、8m時間點骨密度降低,Micro-CT結果示LPS組骨小梁BV/TV下降(P0.05)、Tb.N減少(P0.05)、Tb.Th減少(P0.05)、Tb.Sp增高(P0.05)、SMI增高(P0.05),同時,骨皮質BV/TV下降(P0.05)、C.Th減少(P0.05)。3.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期生長板窄于對照組(P0.05)、骨小梁比對照組稀疏,破骨細胞Oc.S/BS、N.Oc/t.Ar、N.Oc/B.Pm高于對照組(P0.05)。4.出生早期LPS刺激的小鼠在成年期2m、4m、8m時間點的成骨相關基因(OP、OC)(P0.05)表達降低、破骨相關基因(Tracp、Ctsk、Mmp9)表達增高(P0.05)。結論:第一部分:LPS通過抑制軟骨增生、分化及促進肥大帶軟骨細胞凋亡來抑制胚胎期小鼠骨骼發(fā)育。胚胎期LPS刺激導致小鼠成年期骨量降低,可能與成骨細胞分化相關基因表達下降、破骨細胞吸收相關基因表達增加,破骨數(shù)量增加、骨吸收活性增強有關。第二部分:出生早期一過性LPS刺激可抑制小鼠骨骼發(fā)育,且其成年期出現(xiàn)骨量降低,可能與骨形成抑制及骨吸收增強有關。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R580

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