本文關鍵詞：SIV入侵血腦屏障的分子機制探討

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【摘要】：獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)簡稱艾滋病,是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染機體后,引起的一種以細胞免疫功能缺陷、反復機會性感染、惡性腫瘤及中樞神經系統(tǒng)退行性病變?yōu)樘攸c的綜合癥。HIV進入人體后,不僅攻擊免疫系統(tǒng),還常常伴隨有嚴重的神經侵襲性,通常的病理變化為星形神經膠質細胞增生為主的神經膠質細胞增生、血管周圍淋巴細胞和巨噬細胞侵潤。臨床上表現為從急性腦炎到HIV癡呆合并癥等一系列不同的變化。在動物模型中,CNS疾病通常與腦實質特別是HIV對膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質神經細胞的直接感染相關。那么,HIV是怎樣進入CNS的呢?目前研究表明,HIV/SIV在感染早期即可穿透血腦屏障(BBB),侵入中樞神經系統(tǒng)(CNS)。關于其感染機制,存在幾種不同的假說,其中比較公認的是：(1)病毒直接侵入假說；(2)單核-巨噬細胞侵入假說；(3)T細胞誘導假說；(4)液相入胞假說等。簡單來說,即病毒以游離病毒的形式或以感染病毒的細胞為載體,藉由上皮細胞或細胞間緊密連接處進入并感染中樞神經系統(tǒng)。那么究竟游離病毒直接感染內皮細胞的感染方式,還是感染的T淋巴細胞介導的感染方式是SIV入侵血腦屏障的主要途徑呢?如果細胞介導的感染方式是主要途徑,那在,感染的淋巴細胞與內皮細胞作用時,又是什么分子發(fā)揮了促進SIV感染內皮細胞的作用呢?第一部分：游離SIVmac239病毒與T細胞介導兩種方式感染內皮細胞的效果比較。游離病毒直接感染與細胞介導兩種感染方式,無疑是HIV/SIV感染細胞的兩種方式。有研究表明,在HIV感染CD4+T細胞時,感染的T細胞與未感染的T細胞間的接觸,會形成一種特殊的結構-病毒學突觸。這種結構會促進HIV病毒從感染細胞到未感染細胞的高效轉移。這種細胞介導的感染方式是游離病毒直接感染方式效率的100倍之多。那么在SIV感染內皮細胞時,感染的T細胞與內皮細胞共培養(yǎng),會不會也由于細胞間的接觸,促進SIV對內皮細胞的感染呢?為此,我們采用游離SIV病毒直接感染內皮細胞和SIV感染的CEMx174細胞與內皮細胞共培養(yǎng)的兩種方式,通過巢式PCR、間接免疫熒光法、Western blotting以及ELISA檢測內皮細胞的感染程度。我們發(fā)現,兩種感染方式都能在內皮細胞內檢測到前病毒DNA。但感染細胞與內皮細胞共培養(yǎng)時,內皮細胞內前病毒DNA含量、SIV P27蛋白表達量和細胞培養(yǎng)上清中P27含量遠高于游離病毒直接感染的方式。所以我們得出結論：細胞介導的感染方式相較于游離病毒直接感染方式對內皮細胞的感染能力更強,可能是SIV病毒入侵血腦屏障的主要途徑。第二部分：CD44分子與透明質酸分子的相互作用對SIV感染內皮細胞的影響。淋巴細胞表面的CD44分子與內皮細胞表面的透明質酸分子參與了淋巴細胞與內皮細胞的相互作用,有證據顯示在體外淋巴細胞表面的CD44分子能通過透明質酸依賴的途徑結合到內皮細胞上。既然T細胞表面的CD44分子與內皮細胞表面的HA分子能相互作用促進淋巴細胞的歸巢,那么這種相互作用又能否促進SIV對內皮細胞的感染呢?為此,我們采用IFA、Western blotting、FCM等方法,通過熒光共定位證明了T淋巴細胞表面的CD44分子確實可以和內皮細胞表面的透明質酸分子相結合,促使淋巴細胞對內皮細胞的粘附作用。通過添加外源性的透明質酸分子與淋巴細胞表面的CD44分子競爭性結合,以及利用透明質酸酶減少透明質在內皮細胞表面的分布有效地降低了SIV通過T細胞介導的途徑對內皮細胞的感染。同理,利用抗體封閉T淋巴細胞CD44分子與透明質酸分子的結合位點,降低CD44-HA的結合,同樣降低了SIV對內皮細胞的感染。第三部分：大鼠間充質干細胞的永生化。由于在研究SIV入侵血腦屏障時,缺乏工具細胞-恒河猴腦毛細血管內皮細胞,導致我們在研究SIV入侵血腦屏障時,使用與腦毛細血管內皮細胞均為CD4-的猴視網膜脈絡叢內皮細胞(RF/6A)。本實驗選用全骨貼壁法分離大鼠的間充質干細胞,14d即可在顯微鏡下觀察到梭形透亮狀態(tài)良好的貼壁細胞,經流式鑒定P3代CD90+細胞占總體細胞的95.6%。通過重組腺病毒介導的方法使hTERT基因在大鼠骨髓間充質干細胞的異位穩(wěn)定表達,誘導端粒酶性,維持細胞染色體核型的穩(wěn)定,目的是使大鼠骨髓間充質干細胞的壽命明顯延長成為具有分化潛能且無限增殖潛能的理想細胞材料。為恒河猴MSC細胞永生化的研究起到了鋪墊作用。而恒河猴MSC細胞永生化無疑為分化出腦毛細血管內皮細胞提供了良好的基礎�？偟膩碚f,我們研究發(fā)現SIV進入BBB的主要途徑應該是以感染細胞為載體對腦內皮細胞的感染。血液中大量感染細胞(單核巨噬細胞和T細胞)與腦內皮細胞之間發(fā)生高效的病毒轉移,使病毒進入腦實質。而游離病毒的直接感染也是病毒進入的途徑,但由于其感染效率較低,不是主要途徑。CD44分子與透明質酸分子在T淋巴細胞與內皮細胞的相互作用中起到了至關重要的作用,當CD44分子與透明質酸分子的結合被減弱時,將有效地降低了SIV通過T細胞介導的途徑對內皮細胞的感染。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.91

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