本文關鍵詞：Rspo1通過Wnt信號通路促進成骨細胞分化

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【摘要】：類風濕關節(jié)炎是一種以慢性侵蝕性關節(jié)炎為特征的全身性自身免疫病。其病理特點是關節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成。研究表明,Wnt信號通路同類風濕關節(jié)炎引起的骨代謝改變有著密切的聯(lián)系,在類風濕關節(jié)炎患者病情發(fā)展中,Wnt信號途徑受抑,進而抑制了成骨細胞增殖、分化,促進了骨質疏松、骨質侵蝕的發(fā)展。近幾年,Rspo1(R-脊椎蛋白1)作為Wnt信號通路的激活劑被研究甚多,但不清楚它能否通過激活Wnt信號通路作用于成骨細胞。目前尚無有效的措施來改善和延緩類風濕關節(jié)炎骨侵蝕病情的進展,明確其骨侵蝕發(fā)生機制可為類風濕關節(jié)炎骨侵蝕的臨床治療提供科學依據(jù)。一、研究目的本實驗通過構建含有TCF熒光素酶報告基因的C2C12細胞,檢測其在Rspo1、Wnt-3a等刺激下,骨保護素、堿性磷酸酶及胞內β-catenin蛋白含量的變化,以研究Rspo1是否通過Wnt信號通路來促進成骨細胞分化,從而為防治類風濕關節(jié)炎骨侵蝕增添新理論和新手段。二、研究方法采用DMEM培養(yǎng)基對C2C12細胞進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。將擴增了的C2C12細胞進行計數(shù),以4×104/ml的濃度加入48孔培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)備用。首先,采用Roche公司x CELLIgence技術的細胞動力學模型分析系統(tǒng),研究RSpo1及Wnt3a對C2C12細胞增殖的影響。其次,應用Lipofectamine 2000將TCF報告質粒及p RL-SV40報告質粒共轉染入C2C12細胞,繼續(xù)培養(yǎng)。接著,我們通過檢測骨成熟標志物堿性磷酸酶、骨保護素來驗證Rspo1對C2C12細胞的作用。處理組細胞加入50ng/ml的Rspo1刺激因子,空白對照組為空,采用ELASA檢測法,收集各組細胞上清液測骨保護素水平,裂解各組細胞測胞內堿性磷酸酶水平。隨后增加了50ng/ml Wnt3a組和50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組,同樣采用ELASA檢測法,收集各組細胞上清液測骨保護素水平,裂解各組細胞測胞內堿性磷酸酶水平,并采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。β-catenin蛋白是Wnt信號通路中的關鍵蛋白,其進入核內后可與TCF質粒相結合,從而激活下游靶基因的轉錄。通過對TCF熒光素酶報告基因和β-catenin蛋白的檢測可反應Wnt信號通路的激活狀態(tài)。接著,C2C12細胞轉染入TCF報告質粒及p RL-SV40報告質粒6h后,更換含不同濃度的Rspo1、Wnt3a及兩者都有的新鮮完全培養(yǎng)基,24h后應用Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測報告基因轉錄活性。最后,我們對50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對照組細胞的β-catenin蛋白進行Western blot檢測,并進行統(tǒng)計學分析。三、結果1.xCELLIgence系統(tǒng)檢測顯示RSpo1對C2C12細胞增殖沒有影響,Wnt3a對C2C12細胞增殖有促進作用。2.在50ng/ml Rspo1組與空白對照組兩組之間,使用堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測堿性磷酸酶、Elisa試劑盒檢測骨保護素,Rspo1組可上調堿性磷酸酶活性、促進骨保護素的分泌,進行方差分析,兩組之間有顯著性差異,P0.05,具有統(tǒng)計學意義。3.在50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對照組四組之間,同樣檢測堿性磷酸酶、骨保護素,兩兩之間進行分析。50ng/ml Rspo1組與空白對照組比較,結果同結果2一樣;50ng/ml Wnt3a組與空白組比較,兩組之間有顯著性差異,P0.01;50ng/ml Wnt3a組與50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a比較,兩組之間有顯著性差異,P0.01。4.檢測被濃度遞增的Rspo1、Wnt3a及兩者共刺激處理下細胞的報告基因活性,根據(jù)繪制曲線圖,可發(fā)現(xiàn)RSpo1對TCF報告質粒激活作用不明顯;Wnt3a可激活TCF報告質粒,并且呈劑量依賴性;RSpo1和Wnt3a聯(lián)合則有協(xié)同疊加作用。5.對50ng/ml Rspo1組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組以及空白對照組四組之間胞內的β-catenin進行Western Blot檢測,根據(jù)蛋白電泳條帶顏色從深到淺排列順序為50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Wnt3a組、50ng/ml Rspo1組、空白對照組;50ng/ml Rspo1組與空白對照組比較,蛋白條帶顏色稍深、柱狀圖稍高,但兩組之間無顯著性差異,P0.05;50ng/ml Wnt3a組與空白對照組比較,有顯著性差異,P0.05;50ng/ml Rspo1+50ng/ml Wnt3a組與50ng/ml Wnt3a組比較,有顯著性差異,P0.05。四、結論1.RSpo1并不能促進C2C12細胞的增殖;2.RSpo1可協(xié)同Wnt3A促進C2C12細胞向成骨細胞分化,表達堿性磷酸酶、骨保護素;3.單獨RSpo1對Wnt信號通路激活作用不明顯;4.RSpo1協(xié)同Wnt3A活化Wnt/β-catenin信號通路,通過協(xié)同激活該通路參與骨代謝,促進成骨細胞分化。
【關鍵詞】：類風濕關節(jié)炎 Wnt/β-catenin信號通路 Rspo1 Wnt3A C2C12細胞
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-15
• 課題設計15-17
• 實驗材料與方法17-30
• 一、實驗材料17-20
• 二、實驗方法20-30
• 實驗結果30-39
• 討論39-41
• 結論41-42
• 參考文獻42-44
• 綜述 Rspo1通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在成骨細胞分化增殖中調節(jié)作用的研究進展44-52
• 綜述參考文獻48-52
• 發(fā)表論文和參加科研工作情況52-53
• 致謝53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳曉虎;孫瑜隆;騫愛榮;李京寶;商澎;;破骨細胞的形成和活化研究進展[J];中國細胞生物學學報;2014年02期

2 Roel NUSSE;Wnt signaling in disease and in development[J];Cell Research;2005年01期

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本文編號：1022896