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發(fā)布時間：2017-08-30 08:14

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導RNA干擾UBE2C基因?qū)η傲邢侔┘毎曜饔玫膶嶒炑芯?/strong>

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【摘要】：目的探討RNA干擾慢病毒重組顆粒(LV-sh RNA-UBE2C)介導人類泛素偶聯(lián)酶E2C(ubiquitin-conjugating enzyme E2C,UBE2C)基因沉默后,對人前列腺癌細胞株UBE2C基因的表達、細胞增殖、細胞侵襲及遷移、克隆形成的影響。方法1.使用實時定量RT-PCR(real-time reverse transcription and polymerase Chain reaction,RT-PCR)檢測UBE2Cm RNA在前列腺癌LNCap、PC3、DU145和C4-2四種細胞株的表達水平。以蛋白印跡(Western blot)技術(shù)檢測UBE2C蛋白在LNCap、PC3、DU145、C4-2四種前列腺癌細胞株中的表達水平,并篩選實驗用的細胞。2.根據(jù)RNAi的設計原則,進行設計合成特異性的靶向UBE2C的sh RNA表達載體(LV-sh RNA-UBE2C)及陰性對照組LV-sh RNA-NC,并且有美國Gene Copoeia公司包裝合成慢病毒顆粒。3.將人前列腺癌PC3及DU145細胞株分別隨機分為3組:LV-sh RNA-UBE2C實驗組、LV-sh RNA-NC陰性對照組及空白對照組。實驗組LV-sh RNA-UBE2C基因沉默組慢病毒顆粒進行感染PC3及DU145細胞細胞;LV-sh RNA-NC陰性對照組為對照慢病毒顆粒LV-sh RNA-NC感染PC3及DU145細胞;空白對照組為PC3及DU145細胞株常規(guī)的進行培養(yǎng),不進行任何的處理。應用實時定量RT-PCR和蛋白印跡方法來檢測UBE2C m RNA及蛋白的表達水平來評價慢病毒顆粒的干擾的效果。4.應用MTT法檢測各組細胞在體外的增殖能力,Transwell小室實驗檢測細胞侵襲及遷移能力,平板克隆形成實驗檢測各組細胞的克隆形成,流式細胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)分別檢測各組細胞增殖情況。結(jié)果1.RT-PCR結(jié)果顯示在LNCap、PC3、DU145和C4-2四種人前列腺癌細胞中UBE2Cm RNA均有表達,并且在PC3及DU145細胞內(nèi)表達較高,其中在PC3細胞內(nèi)表達最高。2.蛋白印跡結(jié)果顯示人前列腺癌PC3及DU145細胞中UBE2C基因表達水平在四種細胞中的表達水平中顯示較高,其中在PC3細胞內(nèi)表達最高3.RT-PCR及蛋白印跡法結(jié)果顯示:在PC3及DU145細胞中,實驗組LV-sh RNA-UBE2C和陰性對照組LV-sh RNA-NC及空白對照組比較,UBE2C m RNA及蛋白的表達水平下調(diào),差別顯著(p0.05)。4.MTT法顯示:LV-sh RNA-UBE2C組細胞在轉(zhuǎn)染后48、72小時的OD490值均低于LV-sh RNA-NC陰性對照組、空白對照組,差別顯著(p0.05)。5.平板克隆形成實驗法顯示:LV-sh RNA-UBE2C組的克隆形成能力明顯低于LV-sh RNA-NC陰性對照組、空白對照組,LV-sh RNA-UBE2C實驗組細胞生長明顯受到抑制(p0.05)。6.Transwell實驗顯示LV-sh RNA-UBE2C組細胞遷移及侵襲能力較空白對照組和陰性對照組LV-sh RNA-NC下降(p0.05)。7.流式細胞技術(shù)顯示:LV-sh RNA-UBE2C實驗組較LV-sh RNA-NC陰性對照組、空白對照組G1期延長,S期縮短,差別顯著(p0.05)。結(jié)論1.慢病毒介導的UBE2C基因干擾能穩(wěn)定有效地表達于人前列腺癌細胞,篩選出能穩(wěn)定干擾UBE2C基因表達的sh RNA序列和試驗用的人前列腺癌PC3及DU145細胞株。2.UBE2C慢病毒干擾載體可有效沉默人前列腺癌PC3及DU145細胞UBE2C基因,下調(diào)人前列腺癌PC3及DU145細胞UBE2C基因的表達。針對UBE2C的sh RNA慢病毒顆粒能夠有效的阻斷人前列腺癌PC3及DU145細胞株中UBE2Cm RNA及蛋白的表達,并以此抑制細胞的生長增殖,下調(diào)細胞的侵襲、遷移能力,降低細胞的克隆形成能力。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 RNA干擾 前列腺癌 細胞增殖 細胞侵襲
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、慢病毒介導RNAi對人前列腺癌細胞UBE2C表達的影響15-40
• 1 材料和方法15-32
• 1.1 主要儀器及試劑15-19
• 1.2 實驗方法19-32
• 1.2.1 慢病毒顆粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、重組19-21
• 1.2.2 細胞培養(yǎng)及相關(guān)操作21-22
• 1.2.3.實時定量RT-PCR檢測22-25
• 1.2.4.蛋白印跡法檢測25-29
• 1.2.5.慢病毒液的滴度測定29-30
• 1.2.6.細胞轉(zhuǎn)染30-32
• 1.2.7.統(tǒng)計學分析32
• 2 結(jié)果32-36
• 3 討論36-39
• 4 小結(jié)39-40
• 二、下調(diào)UBE2C表達影響人前列腺癌細胞株生物學行為40-53
• 1 材料和方法40-44
• 1.1 材料40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 方法40-44
• 1.3.1 細胞培養(yǎng)相關(guān)操作40
• 1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染40-41
• 1.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染41
• 1.3.4 MTT法分析細胞增殖41-42
• 1.3.5 平板克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成42-43
• 1.3.6 Transwell小室細胞遷移實驗43
• 1.3.7 Transwell小室細胞侵襲實驗43-44
• 1.3.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期44
• 1.3.9 統(tǒng)計學分析44
• 2 結(jié)果44-50
• 3 討論50-52
• 4 小結(jié)52-53
• 全文結(jié)論53-54
• 參考文獻54-57
• 發(fā)表論文57-58
• 綜述 UBE2C與腫瘤關(guān)系的研究進展58-64
• 綜述發(fā)表文獻62-64
• 致謝64-65
• 個人簡歷65

，

本文編號：758195

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