本文關(guān)鍵詞：聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞及GDNF的生物可降解膜系統(tǒng)的性質(zhì)研究

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【摘要】：神經(jīng)修復(fù)在臨床上一直是一個(gè)困擾著臨床醫(yī)生的難題,近年來(lái)隨著科學(xué)的進(jìn)步,在損傷神經(jīng)修復(fù)方面獲得了可喜的進(jìn)步。而目前前列腺癌的發(fā)病率逐年上升,其治療的金標(biāo)準(zhǔn)是采用根治手術(shù)切除前列腺,而手術(shù)過(guò)程中會(huì)因?yàn)殂Q夾、燒灼、牽拉等原因不可避免的造成海綿體神經(jīng)的損傷。更為特殊的是,海綿體神經(jīng)擁有著獨(dú)特的網(wǎng)狀神經(jīng)結(jié)構(gòu),目前仍沒(méi)有理想的方式來(lái)進(jìn)行受損海綿體神經(jīng)的修復(fù)。針對(duì)海綿體神經(jīng)的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu),我們擬采用膜狀結(jié)構(gòu)全面覆蓋在受損的海綿體神經(jīng)段上,以起到支撐、保護(hù)和引導(dǎo)海綿體神經(jīng)再生的作用。靜電紡絲技術(shù)是目前支架結(jié)構(gòu)的新興技術(shù),應(yīng)用該技術(shù)制造的納米纖維支架具有較大的比表面積和較高的孔隙率,不但有利于生長(zhǎng)因子、酶等生物大分子的吸附,還有利于細(xì)胞的附著和鋪展,同時(shí)有利于細(xì)胞和微環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)交換。聚乳酸—乙醇酸聚合物[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid),PLGA]具有良好的生物相容性和可降解性,運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)和PLGA材料可以制作出理想的細(xì)胞支架。嗅鞘細(xì)胞(Olfactory Ensheathing cells,OECs)是來(lái)源于嗅上皮基底膜的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,其分布區(qū)域位于嗅神經(jīng)和嗅球,可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞粘附因子,起到幫助損傷神經(jīng)元存活、促進(jìn)軸突再生和髓鞘化的作用,在神經(jīng)再生中扮演著重要的角色。GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)是最有效的體外支持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有保護(hù)損傷神經(jīng)、減少神經(jīng)元死亡、促進(jìn)神經(jīng)纖維再生和幫助運(yùn)動(dòng)功能重建的功效。在第一部分,我們采用了改良的Nash法培養(yǎng)了高純度的OECs,免疫熒光鑒定了其純度。在第二部分,我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞獲得了高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞,并用GFP熒光表達(dá)、蛋白印跡和PCR法加以證實(shí)。第三部分,我們將高表達(dá)GDNF的OECs種于電紡PLGA膜上,從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證了其生物相容性。最終我們得到了聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞及GDNF的電紡PLGA可降解膜系統(tǒng),這是一個(gè)理想的生物工程學(xué)神經(jīng)移植物。第一部分嗅球源OECs分離、培養(yǎng)及鑒定目的從大鼠嗅球取材原代嗅鞘細(xì)胞,光鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況,運(yùn)用免疫熒光技術(shù)鑒定嗅鞘細(xì)胞純度。方法采用改良的Nash法從120g大鼠嗅球中取材嗅鞘細(xì)胞,運(yùn)用包含b FGF、Forskolin和20%FBS的DEME/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞,在光鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況,使用p75NGFR免疫熒光染色鑒定嗅鞘細(xì)胞純度。結(jié)果采用改良的nash法,我們成功的獲得了活性高、狀態(tài)好、增殖能力強(qiáng)的嗅鞘細(xì)胞,體外最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)30天,但是細(xì)胞活性狀態(tài)較好的天數(shù)為14天內(nèi)。p75NGFR免疫熒光顯示嗅鞘細(xì)胞純度在95%以上。結(jié)論采用改良的nash法可以獲得高純度的原代嗅鞘細(xì)胞,但是嗅鞘細(xì)胞是成熟的體細(xì)胞,不具有無(wú)限增殖的特性,在體外雖然可以大量增殖,但是存活時(shí)間有限,需要在30天內(nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),超過(guò)30天后細(xì)胞活性差且細(xì)胞大量死亡,最佳天數(shù)是在14天以?xún)?nèi)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。第二部分慢病毒轉(zhuǎn)染獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞及鑒定目的獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞,并鑒定其能否高表達(dá)GDNF。以聯(lián)合GDNF和嗅鞘細(xì)胞共同用于神經(jīng)修復(fù)。方法運(yùn)用含有GDNF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞,在熒光下觀(guān)察細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況確定病毒轉(zhuǎn)染率,應(yīng)用PCR驗(yàn)證GDNF基因過(guò)表達(dá)情況,應(yīng)用蛋白印跡驗(yàn)證GDNF蛋白生成情況。結(jié)果熒光下觀(guān)察到細(xì)胞GFP表達(dá)在MOL為50:1的情況下為50%,表明病毒轉(zhuǎn)染率為50%。同時(shí)PCR驗(yàn)證GDNF基因過(guò)表達(dá)情況為對(duì)照組正常細(xì)胞的130倍。蛋白印跡分析顯示高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞能產(chǎn)生GDNF蛋白,而正常的嗅鞘細(xì)胞蛋白印跡結(jié)果為陰性。結(jié)論通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞可以獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞,其細(xì)胞狀態(tài)好,增殖活性強(qiáng),能夠用于細(xì)胞移植來(lái)修復(fù)神經(jīng)。第三部分電紡PLGA膜與嗅鞘細(xì)胞生物相容性研究目的探索大鼠嗅鞘細(xì)胞和靜電紡絲制作的PLGA膜的生物相容性。方法體外培養(yǎng)純化成年大鼠嗅鞘細(xì)胞,接種于靜電紡絲PLGA膜上,使用相差顯微鏡觀(guān)察和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)評(píng)估細(xì)胞在PLGA膜上的粘附和生長(zhǎng)情況;將靜電紡絲PLGA膜植入大鼠體內(nèi)觀(guān)察其在體內(nèi)的組織相容性。結(jié)果相差顯微鏡顯示嗅鞘細(xì)胞能在靜電紡絲PLGA膜上粘附和存活;細(xì)胞計(jì)數(shù)分析表明細(xì)胞增殖正常;電鏡下嗅鞘細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好;體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)靜電紡絲PLGA膜與周?chē)M織融合并部分降解。結(jié)論嗅鞘細(xì)胞在靜電紡絲PLGA膜上良好生長(zhǎng),體內(nèi)移植后組織相容性好,是進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)很有潛力的組織工程化神經(jīng)移植物。
【關(guān)鍵詞】：嗅鞘細(xì)胞 GDNF PLGA 靜電紡絲
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 原代OECs分離、培養(yǎng)及鑒定15-25
• 一、材料與方法15-19
• 二、結(jié)果19-21
• 三、討論21-22
• 參考文獻(xiàn)22-25
• 第二部分 慢病毒轉(zhuǎn)染獲得高表達(dá)GDNF的嗅鞘細(xì)胞及鑒定25-37
• 一、材料與方法25-31
• 二、結(jié)果31-33
• 三、討論33-35
• 參考文獻(xiàn)35-37
• 第三部分 電紡PLGA膜與嗅鞘細(xì)胞生物相容性研究37-49
• 一、材料與方法37-41
• 二、結(jié)果41-44
• 三、討論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 總結(jié)49-50
• 綜述50-60
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 在讀碩士期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明60-61
• 致謝61

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本文編號(hào)：700710