本文關(guān)鍵詞：褪黑素緩解白消安造成的小鼠精原干細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡損傷機(jī)理的研究

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【摘要】：最新的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明,中國(guó)每年新增的白血病患者,兒童已經(jīng)占50%左右,這個(gè)比例正在逐年增加。在兒童惡性腫瘤中,白血病已經(jīng)居于首位,且多發(fā)生于男性未成年的兒童。傳統(tǒng)的化療藥物白消安已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于造血干細(xì)胞移植預(yù)處理,但是這種細(xì)胞周期非特異性的烷化劑會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期服用的男性出現(xiàn)不育的癥狀。隨著治療方法的改進(jìn),許多兒童和青少年白血病患者都可生存至成年并有生育要求。目前,對(duì)于不同劑量白消安導(dǎo)致睪丸生精障礙和白消安停藥后恢復(fù)的中、長(zhǎng)期研究資料匾乏。白消安在實(shí)驗(yàn)中被廣泛的應(yīng)用于制備精原干細(xì)胞移植受體。其利用白消安清除內(nèi)源性的生精細(xì)胞,再移植外源性的精原干細(xì)胞到受體睪丸中,從而研究精子發(fā)生等一些列實(shí)驗(yàn)。不同物種使用白消安的劑量具有很大的差異:小鼠腹腔注射劑量約為20-40 mg/kg,大鼠腹腔注射劑量約為15 mg/kg,8-12 mg/kg劑量的白消安腹腔注射后很有可能使得獼猴生精功能不可恢復(fù)。腹腔注射白消安后,機(jī)體通過體液循環(huán)將其運(yùn)送到睪丸組織,導(dǎo)致睪丸曲細(xì)精管中生殖細(xì)胞的發(fā)生過程受到損傷。如果未損傷精原干細(xì)胞,停止注射白消安后,經(jīng)過8-10周,睪丸中精子的再生功能就可以重新啟動(dòng),生殖細(xì)胞即可進(jìn)行正常的減數(shù)分裂。因此,研究白消安對(duì)睪丸中生殖細(xì)胞損傷的機(jī)理以及減少其副作用是非常有必要的。本研究采用ICR小鼠作為研究對(duì)象,腹腔注射白消安,建立無精癥小鼠模型,從而研究白消安的生殖毒理機(jī)制。首先,構(gòu)建好模型后,通過形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、免疫熒光染色、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)確認(rèn)白消安首先影響睪丸中精原干細(xì)胞,其次為精母細(xì)胞,且這種影響呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。進(jìn)一步采用TUNEL染色、流式凋亡檢測(cè)、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、WB、PCR等手段確定白消安激活細(xì)胞內(nèi)p38信號(hào)通路,從而引起細(xì)胞凋亡。在機(jī)理研究上,我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,發(fā)現(xiàn)白消安加入后,細(xì)胞內(nèi)H2O2、O2-水平大幅度上升,且MnSOD、SIRT1等清除氧自由基的相關(guān)基因的表達(dá)明顯受到抑制。通過檢測(cè)GSH/GSSG的比率,白消安能夠?qū)SH產(chǎn)生毀滅性的消耗,極大的破壞細(xì)胞內(nèi)ROS平衡。JC-1染色發(fā)現(xiàn),失衡的ROS會(huì)影響線粒體的膜電位,從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。我們采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),褪黑素能夠有效的緩解白消安所致的小鼠睪丸細(xì)胞損傷,但是具有時(shí)間依賴性,已經(jīng)造成的損傷無法逆轉(zhuǎn);體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),褪黑素能夠有效地緩解白消安導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS失衡,從而減少細(xì)胞凋亡的比率。本實(shí)驗(yàn)初步證明了白消安導(dǎo)致小鼠無精癥的機(jī)理,并且確定白消安會(huì)造成生殖細(xì)胞凋亡主要是通過破壞細(xì)胞內(nèi)ROS平衡,激活p38信號(hào)通路,而不是p53信號(hào)通路。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了褪黑素能夠有效地緩解白消安造成的細(xì)胞凋亡,挽救由于白消安所致的無精癥。為臨床上治療白消安并發(fā)癥提供了一定的指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：白消安 精原干細(xì)胞 褪黑素 氧化應(yīng)激(ROS) 凋亡
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.7;R698
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-20
• 第一章 白消安和褪黑素在精原干細(xì)胞損傷中的研究進(jìn)展13-20
• 1.1 精原干細(xì)胞與精子發(fā)生13-14
• 1.2 白消安研究進(jìn)展14-16
• 1.2.1 白消安簡(jiǎn)介14-15
• 1.2.2 白消安在臨床中的應(yīng)用15
• 1.2.3 白消安與精子發(fā)生15-16
• 1.2.4 白消安與氧化應(yīng)激16
• 1.3 抗白消安損傷藥物的研究進(jìn)展16
• 1.4 褪黑素的研究進(jìn)展16-20
• 1.4.1 褪黑素的抗氧化作用16-17
• 1.4.2 褪黑素受體及其信號(hào)通路17-19
• 1.4.3 褪黑素與雄性生殖19
• 1.4.4 褪黑素的應(yīng)用19-20
• 試驗(yàn)研究20-59
• 第二章 白消安對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞的影響20-36
• 2.1 材料和方法20-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.1.4 相關(guān)試劑配制方法21-23
• 2.1.5 白消安受體鼠的制備23
• 2.1.6 白消安處理后受體鼠睪丸形態(tài)學(xué)與睪體比的分析23
• 2.1.7 白消安處理后受體鼠睪丸組織學(xué)分析23-24
• 2.1.8 白消安處理后受體鼠睪丸組織特異性蛋白免疫熒光染色分析24
• 2.1.9 不同類型睪丸細(xì)胞經(jīng)白消安處理后細(xì)胞活力分析24-25
• 2.1.10 白消安處理后受體鼠睪丸組織懸液制備25
• 2.1.11 受體鼠睪丸懸液流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期、凋亡檢測(cè)分析25
• 2.1.12 受體鼠睪丸組織切片TUNEL凋亡檢測(cè)分析25-26
• 2.1.13 受體鼠睪丸組織定量檢測(cè)分析26-27
• 2.1.14 Western Blot檢測(cè)白消安對(duì)于C18-4 的影響27-28
• 2.1.15 穩(wěn)定性分析28
• 2.2 結(jié)果28-34
• 2.2.1 白消安會(huì)造成小鼠睪丸萎縮、睪體比下降28
• 2.2.2 白消安會(huì)造成小鼠精原細(xì)胞丟失28-29
• 2.2.3 白消安對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞活力的影響具有時(shí)間、劑量依賴性29-30
• 2.2.4 白消安會(huì)造成小鼠睪丸細(xì)胞周期阻滯30-31
• 2.2.5 白消安會(huì)造成小鼠睪丸內(nèi)精原細(xì)胞凋亡31-32
• 2.2.6 白消安會(huì)造成小鼠睪丸細(xì)胞應(yīng)激水平增高32-33
• 2.2.7 白消安造成細(xì)胞凋亡是通過p38-ERK通路33-34
• 2.3 討論34-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第三章 褪黑素能夠緩解白消安引起的小鼠睪丸細(xì)胞凋亡36-49
• 3.1 材料和方法36-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑36
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器36-37
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制方法37-38
• 3.1.5 褪黑素挽救白消安損傷模型的建立38
• 3.1.6 睪丸中褪黑素受體檢測(cè)38
• 3.1.7 褪黑素對(duì)于C18-4 細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因的功能檢測(cè)38-39
• 3.1.8 褪黑素挽救白消安損傷模型小鼠睪丸組織學(xué)檢測(cè)39
• 3.1.9 褪黑素挽救白消安損傷模型小鼠睪丸中減數(shù)分裂檢測(cè)39-40
• 3.1.10 褪黑素緩解白消安對(duì)于C18-4 細(xì)胞毒性檢測(cè)40
• 3.1.11 數(shù)據(jù)及穩(wěn)定性分析40
• 3.2 結(jié)果40-48
• 3.2.1 小鼠睪丸中有褪黑素受體MT1、MT2的表達(dá)40-41
• 3.2.2 褪黑素能夠促進(jìn)C18-4 細(xì)胞內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)41-42
• 3.2.3 褪黑素能夠有效的挽救白消安注射1周后小鼠曲細(xì)精管中的細(xì)胞42-43
• 3.2.4 褪黑素能夠有效的挽救白消安注射2周后小鼠曲細(xì)精管中的細(xì)胞43-44
• 3.2.5 褪黑素不能夠有效的挽救白消安注射3周后小鼠曲細(xì)精管中的細(xì)胞44-45
• 3.2.6 褪黑素能夠有效的緩解白消安的細(xì)胞毒性45-46
• 3.2.7 褪黑素能夠抑制P38信號(hào)通路從而緩解白消安所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡46-48
• 3.3 討論48
• 3.4 小結(jié)48-49
• 第四章 褪黑素能夠通過保護(hù)線粒體抑制ROS從而緩解白消安的細(xì)胞毒性49-59
• 4.1 材料和方法49-52
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料49
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑49
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器49
• 4.1.4 主要實(shí)驗(yàn)溶液的配制49-50
• 4.1.5 褪黑素、白消安處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)50
• 4.1.6 褪黑素、白消安處理后細(xì)胞內(nèi)GSH/ GSSG檢測(cè)50-51
• 4.1.7 褪黑素、白消安處理后細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位檢測(cè)51-52
• 4.1.9 穩(wěn)定性分析52
• 4.2 結(jié)果52-57
• 4.2.1 褪黑素能夠有效的緩解白消安所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS積累52-53
• 4.2.2 褪黑素能夠有效地保護(hù)細(xì)胞內(nèi)GSH的平衡53-54
• 4.2.3 褪黑素能夠有效的保護(hù)線粒體膜電位平衡54
• 4.2.4 褪黑素通過提高SIRT1、MnSOD的表達(dá)抑制白消安毒性54-57
• 4.3 討論57-58
• 4.4 小結(jié)58-59
• 結(jié)論59
• 創(chuàng)新點(diǎn)59
• 進(jìn)一步研究課題59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 附錄67-71
• 縮略詞71-72
• 致謝72-73
• 作者簡(jiǎn)介及攻讀碩士學(xué)位期間的主要研究成果73

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8 張善堂;方焱;孫自敏;劉會(huì)蘭;耿良權(quán);唐麗琴;孫言才;吳云;譙川南;屈建;;靜脈輸注白消安在異基因造血干細(xì)胞移植預(yù)處理患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[A];2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集[C];2010年

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本文編號(hào)：669170