本文關鍵詞：miR-200a調控β-catenin在腎小管上皮細胞轉分化中的作用

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【摘要】：背景和目的:腎間質纖維化(renal interstital fibrosis,RIF)是各種不同類型的慢性腎臟病進行性發(fā)展的最終結局。腎小管上皮間質轉分化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)是RIF的重要發(fā)病機制。Wnt/β-catenin信號通路是一個復雜、保守的細胞間生物通路,在生物發(fā)育和疾病中調控著細胞功能、表型等。β-catenin是Wnt/β-catenin信號轉導通路的關鍵分子,在不同類型的纖維化疾病中起著重要作用。MicroRNAs(miRNAs)是生物體內(nèi)一類非編碼小RNA,參與調節(jié)細胞的增殖、分化與凋亡。近年來隨著miR-200a在腫瘤方面研究的深入,其在纖維化疾病的作用日益受到重視。有研究報道m(xù)iR-200a在肝、肺纖維化中起著重要作用,但miR-200a在腎間質纖維化中的作用機制仍不清楚。本課題用TGF-β1誘導HK-2細胞上皮間質轉分化,觀察miR-200a和β-catenin的表達變化;用雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實miR-200a以β-catenin的基因CTNNB1為靶標;以外源性干預miR-200a的表達,觀察其對β-catenin和上皮細胞間質轉分化的影響;用干擾RNA阻斷β-catenin表達,反證β-catenin在miR-200a調控小管上皮間質轉分化中的重要作用。確立miR-200a直接以β-catenin為靶點調控小管上皮間質轉分化。這為干預腎間質纖維化的發(fā)生提供了新的實驗依據(jù),為腎間質纖維化的治療提供新靶點。方法:1.TGF-β1誘導對體外培養(yǎng)HK-2細胞miR-200a和β-catenin的影響,將HK-2細胞,分為0h組、12h組、24h組、48h組,用終濃度為10ng/ml的TGF-β1分別作用12h、24h、48h;q PCR檢測各組miR-200a的表達,q PCR和Western Blot檢測各組HK-2細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況。2.agomir(miR-200a激動劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對HK-2細胞miR-200a表達的影響,HK-2細胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;(2)NC-miRNA組:向細胞轉染NC-miRNA(陰性對照miRNA);(3)agomir組:向細胞轉染agomir(50n M);(4)antagomir組:向細胞轉染antagomir(100n M)。48h后q PCR檢測miR-200a的表達情況。3.運用雙熒光素酶報告質粒(β-catenin基因野生型/突變型,CTNNB1 UTR WT/MT)驗證miR-200a與β-catenin的作用靶點關系,HK-2細胞分為4組:(1)control組:向細胞轉染CTNNB1 UTR WT/MT質粒;(2)NC-miRNA組:向細胞轉染CTNNB1 UTR WT/MT質粒和NC-miRNA;(3)antagomir組:向細胞轉染CTNNB1 UTR WT/MT質粒和antagomir;(4)agomir組:向細胞轉染CTNNB1 UTR WT/MT質粒和agomir。48h后雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光活性。4.上調miR-200a(agomir)對TGF-β1誘導的β-catenin及小管EMT的影響,HK-2細胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細胞;(2)TGF-β1組:用10ng/ml TGF-β1誘導HK-2細胞;(3)NC-miRNA+TGF-β1組:向細胞轉染NC-miRNA并用10ng/ml TGF-β1誘導細胞;(4)agomir+TGF-β1組:向細胞轉染agomir并用10ng/ml TGF-β1誘導細胞。48h后q PCR和Western Blot檢測細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況,細胞免疫熒光檢測E-cadherin和α-SMA的表達情況。5.下調miR-200a(antagomir)對β-catenin及小管EMT的影響,HK-2細胞分為3組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;(2)NC-miRNA組:向細胞轉染NC-miRNA;(3)antagomir組:向細胞轉染antagomir。48h后q PCR和Western Blot檢測細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況,細胞免疫熒光檢測E-cadherin和α-SMA的表達情況。6.β-catenin siRNA轉染對細胞β-catenin的影響,HK-2細胞分為3組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;(2)NC-siRNA(干擾RNA的陰性對照)組:向細胞轉染NC-siRNA;(3)si R-β-catenin組:向細胞轉染β-catenin siRNA。各組細胞培養(yǎng)至48h進行q PCR和Western Blot檢測β-catenin表達。7.干擾β-catenin對antagomir誘導的EMT的影響,HK-2細胞分為4組:(1)control組:用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;(2)antagomir組:向細胞轉染antagomir;(3)antagomir+NC-siRNA組:向細胞轉染antagomir和NC-siRNA;(4)antagomir+si R-β-catenin組:向細胞轉染antagomir和β-catenin siRNA。48h后q PCR和Western Blot檢測細胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況。結果:1.TGF-β1誘導下細胞miR-200a、β-catenin及轉分化指標的表達情況q PCR檢測結果示miR-200a在0h組呈高表達,在TGF-β1作用12h時miR-200a表達出現(xiàn)明顯下調(與0h組比,P0.05),48h時miR-200a表達最低(與0h組比,P0.05);β-catenin的mRNA和蛋白在0h組呈低表達,24h出現(xiàn)明顯增多(與0h組比,P0.05),48h上升到最高(與0h組比,P0.05)。E-cadherin的mRNA和蛋白在0h組呈高表達,在24h出現(xiàn)明顯降低(與0h組比,P0.05),48h降到最低(與0h組比,P0.05);α-SMA和FN的表達則與E-cadherin的表達相反,12h出現(xiàn)明顯上調(與0h組比,P0.05),在48h表達最高(與0h組比,P0.05)。提示在TGF-β1誘導小管上皮間質轉分化中miR-200a表達下調,而β-catenin表達上調。2.agomir(miR-200a激動劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對HK-2細胞miR-200a表達的影響q PCR檢測結果示,miR-200a的表達在NC-miRNA組與control組無明顯差別(P0.05);在agomir組miR-200a表達較NC-miRNA組明顯增多(P0.05),在antagomir組其表達較NC-miRNA組明顯減少(P0.05)。提示agomir上調miR-200a表達,antagomir下調miR-200a表達。3.雙熒光素酶實驗檢測miR-200a與β-catenin的作用靶點雙熒光素酶檢測結果顯示,轉染CTNNB1 UTR MT質粒的各組間相對熒光活性比值無明顯差異(P0.05);轉染CTNNB1 UTR WT質粒的各組,control組和NC-miRNA組無明顯差異,但在antagomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯升高(P0.05),在agomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯降低(P0.05)。提示miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標。4.上調miR-200a(agomir)對TGF-β1誘導的β-catenin及小管EMT的影響細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達在TGF-β1組和NC-miRNA+TGF-β1組之間無明顯差異(P0.05);在TGF-β1組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較control組明顯增多(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表達較control組明顯減少(P0.05);在agomir+TGF-β1組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較NC-miRNA+TGF-β1組明顯下調(P0.05),同時較TGF-β1組明顯下調(P0.05),E-cadherin的mRNA和蛋白表達則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯上調(P0.05),同時較TGF-β1組明顯上調(P0.05)。細胞免疫熒光結果與蛋白結果一致,即E-cadherin熒光在TGF-β1組較control組顯著減弱,在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯增強;α-SMA熒光在TGF-β1組較control組明顯增強,在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組顯著減弱。提示上調miR-200a減弱TGF-β1誘導的β-catenin表達,抑制小管上皮間質轉分化5.下調miR-200a(antagomir)對β-catenin及小管EMT的影響細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達在control組與在NC-miRNA組無明顯差別(P0.05);在antagomir組,β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較NC-miRNA組明顯升高(P0.05);E-cadherin的mRNA和蛋白表達則較NC-miRNA組明顯降低(P0.05)。細胞免疫熒光顯示,在control組和NC-miRNA組,E-cadherin出現(xiàn)明顯紅色熒光,α-SMA則有少許微弱的熒光;在antagomir組E-cadherin熒光明顯減弱,α-SMA熒光顯著增強。提示下調miR-200a可增加β-catenin表達,促進小管上皮間質轉分化。6.β-catenin siRNA對細胞β-catenin表達的影響在control組和NC-siRNA組β-catenin的mRNA表達無明顯差別(P0.05),但在si R-β-catenin組,β-catenin表達較NC-siRNA組明顯下調(P0.05);Western Blot結果與q PCR結果相符,即β-catenin表達在control組和NC-siRNA組正常表達,但在si R-β-catenin組較NC-siRNA組表達顯著減少(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制β-catenin表達。7.干擾β-catenin對antagomir誘導的小管上皮間質轉分化的影響細胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達在antagomir組與antagomir+NC-siRNA組無明顯差異(P0.05);在antagomir組,E-cadherin的mRNA和蛋白表達較control組顯著減少(P0.05),α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達則較control組顯著增加;在antagomir+si R-β-catenin組,E-cadherin的mRNA和蛋白表達較antagomir+NC-siRNA組表達上調(P0.05);α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達則較antagomir+NC-siRNA組表達下調(P0.05)。提示β-catenin siRNA抑制antagomir誘導的小管上皮間質轉分化,反證了miR-200a直接調控β-catenin影響腎小管上皮間質轉分化結論:1.在TGF-β1誘導小管上皮間質轉分化中miR-200a表達下調,而β-catenin表達上調;2.miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標;3.上調miR-200a減弱TGF-β1誘導的β-catenin表達,抑制小管上皮間質轉分化;下調miR-200a可增加β-catenin表達,促進小管上皮間質轉分化;4.β-catenin siRNA抑制antagomir誘導的小管上皮間質轉分化,反證了miR-200a直接調控β-catenin影響腎小管上皮間質轉分化;由此得出,miR-200a通過直接以β-catenin為靶標抑制TGF-β1誘導的小管上皮間質轉分化。
【關鍵詞】：miR-200a β-catenin 上皮間質轉分化 腎間質纖維化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-32
• 結果32-46
• 討論46-52
• 全文結論52-53
• 參考文獻53-57
• 文獻綜述 miRNA-200 家族與腎間質纖維化57-63
• 參考文獻60-63
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

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