本文關(guān)鍵詞：HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

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【摘要】：前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。在美國,前列腺癌是引起男性死亡率第二高的癌癥。前列腺癌發(fā)展緩慢,它是雄激素依賴性生長(zhǎng)腫瘤。雄激素阻斷后,前列腺癌會(huì)出現(xiàn)消退。后來出現(xiàn)了激素抵抗型癌細(xì)胞株,可抵抗常規(guī)治療手段并最終導(dǎo)致死亡。因此,開展新型的治療方法來治療激素抵抗型前列腺癌尤為重要。研究表明,滅活仙臺(tái)病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope, HV J-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物,激活多重抗腫瘤免疫,同時(shí)還能直接殺傷腫瘤。本研究中,我們使用HVJ-E來誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及自噬,并初步探討了其可能的作用機(jī)制。首先,我們用HVJ-E處理PC3細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、皺縮和破裂的現(xiàn)象,FACS檢測(cè)顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,PC3細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的凋亡,且呈劑量依賴關(guān)系,提示HVJ-E可直接導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡。為探討HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,我們用Western Blot法檢測(cè)了Caspase信號(hào)通路的相關(guān)蛋白,結(jié)果表明,隨著HVJ-E濃度的升高,caspase-9、caspase-3、PARP均被有效激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證caspase通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們以廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后再用HVJ-E處理,結(jié)果顯示,caspase-3的活化被顯著抑制,同時(shí)FACS檢測(cè)結(jié)果也表明,Z-VAD-FMK可顯著抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率。為進(jìn)一步探究HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,我們以Western Blot法檢測(cè)了MAPK信號(hào)通路中的3個(gè)主要亞族,結(jié)果表明p38、JNK和Erkl/2均被激活。為進(jìn)一步確認(rèn)MAPK通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑SP600125 (7.5μM)、Erk1/2抑制劑U0126 (20μM)預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后,再以HVJ-E處理PC3細(xì)胞,Western Blot結(jié)果顯示,p38、JNK和Erk1/2的激活均被顯著抑制。同時(shí),FACS和CCK-8的檢測(cè)結(jié)果也表明,各抑制劑可下調(diào)HVJ-E誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并減少HVJ-E導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,證實(shí)了MAPK在HVJ-E誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。為深入探明HVJ-E激活MAPK信號(hào)通路的可能機(jī)制,我們測(cè)定了HVJ-E處理PC3細(xì)胞后活性氧(ROS)的產(chǎn)生水平,結(jié)果顯示,隨著HVJ-E濃度的升高,PC3產(chǎn)生ROS的水平也升高,說明HVJ-E可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS。為研究ROS在HVJ-E激活MAPK通路中的作用,我們以活性氧清除劑(NAC)預(yù)處理PC3細(xì)胞30分鐘,然后加入HVJ-E作用24小時(shí)。再經(jīng)FACS法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,NAC能抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率；同時(shí),NAC能抑制MAPK信號(hào)通路中JNK、Erkl/2、P38蛋白的磷酸化,提示ROS可能是HVJ-E激活MAPK信號(hào)通路,并最終導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡的主要因素。自噬在細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用,為研究HVJ-E是否可引起PC3細(xì)胞自噬,我們利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞,觀察自噬小體,并通過LC3I/II的轉(zhuǎn)化計(jì)算,證實(shí)HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞自噬。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路對(duì)自噬為負(fù)調(diào)控,而III型PI3K/becline-1則對(duì)自噬形成正調(diào)控,Western Blot結(jié)果顯示,經(jīng)HVJ-E處理后,AKT、mTOR、p70S6K被激活,同時(shí)Becline-1的表達(dá)也隨著HVJ-E的處理而增強(qiáng)。由此說明PI3K/Becline-1參與了HVJ-E引起的細(xì)胞自噬。為進(jìn)一步研究自噬在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用,我們分別利用自噬誘導(dǎo)劑Rapa和自噬抑制劑CQ分別預(yù)處理PC3細(xì)胞,然后再以HVJ-E進(jìn)行刺激,FACS和CCK-8結(jié)果表明,RAPA可提高HVJ-E致PC3細(xì)胞的凋亡率(p0.01),而CQ對(duì)HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡率沒有影響(p0.05); Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與HVJ-E組對(duì)照組相比,HVJ-E+Rapa組可進(jìn)一步提高JNK、Erk1/2和p38的磷酸化水平,并促進(jìn)caspase-3的裂解,提示促進(jìn)自噬,可提高HVJ-E引起的PC3細(xì)胞凋亡率,這也為研究HVJ-E致腫瘤細(xì)胞凋亡的研究提供了新的借鑒。
【關(guān)鍵詞】：滅活仙臺(tái)病毒 PC3 凋亡 自噬
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 符號(hào)說明10-11
• 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1 仙臺(tái)病毒基本概述12-14
• 1.1 仙臺(tái)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)12
• 1.2 仙臺(tái)病毒的分子生物學(xué)特征12-13
• 1.3 仙臺(tái)病毒生物學(xué)功能發(fā)揮方式13
• 1.4 仙臺(tái)病毒調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答13-14
• 1.5 仙臺(tái)病毒研究展望14
• 2 細(xì)胞凋亡14-17
• 2.1 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理14
• 2.2 細(xì)胞凋亡的特征14-17
• 3 細(xì)胞自噬17-20
• 3.1 自噬的形成17
• 3.2 自噬的分類17-18
• 3.2.1 巨自噬18
• 3.2.2 分子伴侶介導(dǎo)的自噬18
• 3.2.3 微自噬18
• 3.3 自噬在腫瘤中的作用18-20
• 3.3.1 自噬的兩面性18-19
• 3.3.2 自噬的免疫研究19-20
• 第一部分 HVJ-E致PC3凋亡的作用機(jī)制20-37
• 1 材料20-21
• 1.1 細(xì)胞株、病毒20
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 1.3 主要試劑和藥品21
• 2 方法21-29
• 2.1 溶液配制22
• 2.2 滅活仙臺(tái)病毒的制備22-23
• 2.2.1 仙臺(tái)病毒的繁殖22
• 2.2.2 仙臺(tái)病毒的濃縮22-23
• 2.2.3 仙臺(tái)病毒效價(jià)的測(cè)定23
• 2.2.4 仙臺(tái)病毒的滅活及感染力的驗(yàn)證23
• 2.3 PC3細(xì)胞的培養(yǎng)23-24
• 2.4 觀察細(xì)胞形態(tài)24
• 2.5 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果24
• 2.6 FACS(Annexin V/PI雙染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡24-25
• 2.7 FACS(探針DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞活性氧25
• 2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)25-28
• 2.8.1 蛋白樣品制備25
• 2.8.2 測(cè)蛋白濃度25-26
• 2.8.3 蛋白樣品變性26
• 2.8.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳26-27
• 2.8.5 轉(zhuǎn)膜27
• 2.8.6 免疫反應(yīng)27-28
• 2.8.7 化學(xué)發(fā)光、曝光28
• 2.9 檢測(cè)Caspase信號(hào)通路相關(guān)蛋白28
• 2.10 檢測(cè)Z-VAD-FMK預(yù)處理后細(xì)胞的凋亡和Caspase-3蛋白28
• 2.11 檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白28
• 2.12 檢測(cè)MAPK通路各個(gè)抑制劑預(yù)處理后細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白28-29
• 2.13 檢測(cè)NAC預(yù)處理后細(xì)胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白29
• 3. 結(jié)果29-35
• 3.1 HVJ-E對(duì)PC3細(xì)胞增殖活性的影響29-30
• 3.2 HVJ-E對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響30-31
• 3.3 Caspase信號(hào)通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用31-32
• 3.4 MAPK信號(hào)通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用32-33
• 3.5 測(cè)定了PC3細(xì)胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)33-35
• 4. 討論35-37
• 第二部分 自噬在HVJ-E致PC3凋亡中的作用37-42
• 1. 材料37-38
• 1.1 細(xì)胞株、病毒37
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 1.3 主要試劑和藥品38
• 2. 方法38-39
• 2.1 溶液配制38
• 2.2 細(xì)胞免疫熒光觀察自噬小體38
• 2.3 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白38-39
• 2.4 檢測(cè)caspase-3、PARP、LC3的表達(dá)39
• 2.5 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率39
• 3. 結(jié)果39-41
• 3.1 HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生自噬39-40
• 3.2 誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的效應(yīng)40-41
• 4. 討論41-42
• 全文結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-52
• 致謝52-53

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：526148