本文關鍵詞：白藜蘆醇對腎癌細胞的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的檢測NLRP3在腎癌組織和相應的正常腎組織中的蛋白表達水平,探討白藜蘆醇(RSV)對腎癌786-O細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用以及NLRP3炎癥小體信號通路和去乙酰化酶Sirt1在此過程中的作用。方法1.Western blot方法檢測腎癌組織和癌旁正常組織中NLRP3的蛋白表達水平。2.將786-O細胞隨機分為CON對照組、RSV處理組,將RSV處理組分別用25μM、50μM、100μM RSV處理12h、24h、48h,用CCK-8的方法檢測RSV處理后786-O細胞的增殖情況;倒置顯微鏡下觀察經(jīng)過50μM RSV處理后,786-O腎癌細胞在形態(tài)學上的改變;細胞劃痕實驗檢測50μM RSV對786-O腎癌細胞的遷移能力的影響;Transwell體外侵襲實驗檢測50μM RSV對786-O腎癌細胞的侵襲能力的影響;AnnexinV/PI雙染法檢測50μM RSV對786-O腎癌細胞凋亡情況的影響;Western blot檢測50μM RSV作用于786-O腎癌細胞12h、24h、48h后凋亡相關蛋白Bax的表達情況。3.將腎癌786-O細胞隨機分為CON對照組、LPS+ATP處理組、LPS+ATP+RSV處理組(RSV處理組),除CON對照組之外,另兩組均用LPS處理786-O細胞5.5h,隨后加入ATP處理0.5h,RSV處理組于LPS加入前使用50μM RSV預處理腎癌786-O細胞0.5h,且全程含有RSV。利用Real-time PCR的方法檢測LPS處理后各組786-O細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Sirt1的RNA表達水平。同時,用小干擾RNA沉默RSV處理組786-O細胞中Sirt1基因,檢測沉默Sirt1基因以后后786-O細胞中NLRP3、Sirt1的RNA表達情況。結果1.與對照組相比,25μM、50μM、100μM RSV處理786-O細胞12h、24h、48h后,細胞的增殖能力均顯著下降,其中25μM RSV處理12h、24h、48h后的細胞增殖的抑制率分別為10.22±4.02%、23.81±5.19%、31.45±6.15%,50μM RSV處理12h、24h、48h后的細胞增殖的抑制率分別為19.05±4.89%、44.85±3.38%、52.54±6.55%,100μM RSV處理12h、24h、48h后的細胞增殖的抑制率分別為27.47±4.84%、53.55±13.03%、67.02±10.78%。根據(jù)IC50最終選擇50μM RSV作為后續(xù)實驗的藥物濃度。50μM RSV處理后,在倒置顯微鏡下可以觀察到786-O細胞的細胞核濃集,細胞形狀由長梭形或者不規(guī)則形變?yōu)樾A形,細胞邊緣由清晰變模糊,生長狀態(tài)變差。與對照組相比,相同時間內(nèi)50μM RSV處理組細胞遷移的距離顯著小于對照組細胞遷移的距離;50μM RSV處理后,通過基質(zhì)膠到達微孔膜底層的細胞數(shù)目明顯減少,與對照組的39.23±3.64相比,RSV處理后微孔膜底層的細胞數(shù)目僅為11.21±4.19,兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);50μM RSV處理后786-O細胞凋亡的程度顯著增加,對照組細胞凋亡率(UR象限+LR象限)較低,為3.56%,其中早期凋亡率2.08%,晚期凋亡率1.46%,RSV處理組細胞凋亡率(UR象限+LR象限)明顯升高,可達15.27%,其中早期凋亡率3.74%,晚期凋亡率11.53%;50μM RSV處理12h、24h、48h后凋亡相關蛋白Bax的蛋白表達水平與對照組相比升高,并且隨著處理時間的延長786-O細胞內(nèi)的Bax的蛋白表達水平逐漸增加,其中處理48h的蛋白表達量升高最明顯。2.與癌旁正常組織相比,腎癌組織中的NLRP3蛋白表達水平明顯增高(P0.05)。體外實驗中與對照組相比,LPS+ATP處理組NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達水平顯著升高,用RSV預處理后,NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達均被抑制,且與LPS+ATP處理組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),此外Sirt1的蛋白表達水平升高(P0.01);同時凋亡相關蛋白Bax的表達水平升高,說明786-O細胞凋亡增加;沉默Sirt1基因后,RSV降低786-O細胞內(nèi)NLRP3的作用消失,與RSV處理組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),同時Bax的表達水平與RSV處理組相比顯著下降,說明沉默Sirt1對癌細胞具有保護作用。結論綜上所述,RSV處理后腎癌786-O細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制,癌細胞的凋亡增加。在RSV促凋亡的過程中,NLRP3炎癥小體信號通路及其下游分子起重要作用,同時,去乙酰化酶Sirt1參與了NLRP3炎癥小體的活化過程,NLRP3和Sirt1在RSV促進癌細胞凋亡過程中的作用值得進一步探討。
【關鍵詞】：白藜蘆醇 腎癌 炎癥 NLRP3 Sirt1
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-17
• 研究現(xiàn)狀、成果11-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、白藜蘆醇對腎癌 786-O細胞的影響17-34
• 1.1 對象和方法17-26
• 1.1.1 細胞系17
• 1.1.2 常規(guī)試劑和耗材17-18
• 1.1.3 實驗用抗體18
• 1.1.4 實驗所需主要試劑以及主要溶液的配制18-21
• 1.1.5 主要儀器設備21
• 1.1.6 實驗方法21-26
• 1.2 結果26-31
• 1.2.1 CCK-8 法檢測RSV對 786-O細胞增殖的影響26-27
• 1.2.2 白藜蘆醇對 786-O細胞形態(tài)學的影響27-28
• 1.2.3 細胞劃痕實驗檢測白藜蘆醇對 786-O細胞遷移能力的影響28-29
• 1.2.4 Transwell實驗檢測白藜蘆醇對 786-O細胞侵襲能力的影響29-30
• 1.2.5 流式細胞術檢測白藜蘆醇對 786-O細胞凋亡的影響30
• 1.2.6 白藜蘆醇對 786-O細胞凋亡相關蛋白Bax表達的影響30-31
• 1.3 討論31-33
• 1.4 小結33-34
• 二、白藜蘆醇對腎癌 786-O細胞作用機制的探討34-50
• 2.1 對象和方法34-41
• 2.1.1 組織以及細胞系34
• 2.1.2 常規(guī)試劑和耗材34-35
• 2.1.3 實驗用抗體35
• 2.1.4 實驗所需主要試劑以及主要溶液的配制35-38
• 2.1.5 主要儀器設備38
• 2.1.6 實驗方法38-41
• 2.2 結果41-46
• 2.2.1 腎癌組織與癌旁正常組織中NLRP3的蛋白表達水平41-42
• 2.2.2 LPS和ATP共處理 786-O細胞引發(fā)炎癥模型42-43
• 2.2.3 白藜蘆醇對 786-O細胞炎癥模型中相關分子表達水平的影響43-44
• 2.2.4 白藜蘆醇對 786-O細胞炎癥模型Sirt1蛋白表達水平的影響44
• 2.2.5 沉默Sirt1基因后白藜蘆醇對 786-O炎癥模型NLRP3蛋白表達水平的影響44-46
• 2.3 討論46-49
• 2.4 小結49-50
• 結論50-51
• 參考文獻51-59
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明59-60
• 綜述 NLRP3炎癥小體與腫瘤發(fā)生關系的研究進展60-67
• 綜述參考文獻63-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68

  本文關鍵詞：白藜蘆醇對腎癌細胞的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：445820