本文關(guān)鍵詞：動力相關(guān)蛋白-1在缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞焦亡機制中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)發(fā)病率高、死亡率也高,對一些重癥AKI尚缺乏有效的治療方法[1]。線粒體是細胞代謝的主要能量來源,也是調(diào)節(jié)細胞死亡的重要細胞器。細胞損傷或缺氧時,可通過激活Caspase系統(tǒng)或ROS的釋放,啟動不同類型的細胞死亡[2]。致病因素導致腎小管上皮細胞線粒體功能障礙,進而激活多種細胞死亡通路,可能是AKI發(fā)生發(fā)展的重要機制。新近研究表明,焦亡是AKI時腎小管上皮細胞死亡的主要方式,但目前對其發(fā)生機制及信號通路知之甚少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(ACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,Nlrp3)在AKI發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用,并在腎小管上皮細胞焦亡發(fā)生中扮演關(guān)鍵角色,但其上游調(diào)控通路及其機制尚不清楚。目前研究顯示線粒體功能障礙在Nlrp3激活中起到了中樞作用,而動力相關(guān)蛋白-1(dynamin-related protein 1,Drp1)是線粒體分裂的關(guān)鍵“分子開關(guān)”,參與了線粒體功能障礙的發(fā)生發(fā)展[3]。最新研究顯示RNA病毒可通過Drp1介導Nlrp3的激活[4]。但是Drp1、線粒體功能障礙和Nlrp3三者之間的相互關(guān)系及調(diào)控機制尚不明了�；谏鲜霰尘�,我們提出Drp1通過調(diào)控線粒體/Nlrp3軸進而介導AKI中腎小管上皮細胞焦亡的假設。本項目首先驗證急性腎損傷中腎上皮細胞的焦亡效應,再通過分別干預Drp1,線粒體/Nlrp3軸,以研究Drp1、線粒體及炎癥體分子之間的相互作用及調(diào)控機制,為闡釋AKI中腎小管上皮細胞焦亡的發(fā)生機制,尋找AKI治療的新靶點提供新思路。研究內(nèi)容本研究擬采用缺氧復氧(H/R)措施處理人腎小管上皮細胞(HK-2細胞),以模擬HK-2細胞缺血再灌注損傷,并檢測被處理細胞的炎性因子IL-1?以及caspase-1蛋白表達水平及腎小管上皮細胞焦亡情況,探討缺血再灌注(I/R)后人腎小管上皮細胞炎癥及焦亡反應狀態(tài),并檢測HK-2細胞中Nlrp3炎性體、活性氧ROS、Drp1的表達,探討I/R導致HK-2細胞炎性因子IL-1?活化及焦亡的可能機制。同時使用Mdivi-1阻斷Drp1的活性,再檢測H/R的HK-2細胞中Drp1、Nlrp3炎性體表達變化,同時對H/R的HK-2細胞炎性因子IL-1?表達水平、活性氧ROS、腎小管上皮細胞焦亡及焦亡相關(guān)分子表達進行檢測,研究Drp1在炎癥及焦亡反應中的作用及其可能機制。研究步驟1.體外擴增si Nlrp3腺病毒,計算病毒滴度和MOI值,供后續(xù)試驗。2.體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞,用缺氧復氧條件模擬人腎小管上皮細胞缺血再灌注模型。3.用流式細胞儀觀察各組細胞焦亡的情況。4.采用Beckman AU5800全自動生化分析儀對各組細胞上清中乳酸脫氫酶的水平進行檢測。5.激光共聚焦觀察各組細胞活性氧的表達水平。6.采用Western blot法對Nlrp3、caspase-1、Drp1、IL-1?蛋白在各組細胞中的表達進行檢測。實驗結(jié)果1.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞發(fā)生了細胞焦亡。(1)正常對照組:細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶LDH為36.90±1.89 IU/L,流式細胞儀檢測顯示,正常對照組細胞焦亡率僅為0.115%。(2)缺氧/復氧(H/R)組:缺氧復氧24h后,細胞上清液中焦亡相關(guān)分子乳酸脫氫酶顯著升高達58.80±6.58 IU/L,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);人腎小管上皮細胞焦亡率增多至5.27%,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明缺氧復氧能顯著增加人腎小管上皮細胞的焦亡。2.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞Nlrp3炎性體、IL-1β、caspase-1水平升高,沉默Nlrp3能減少Nlrp3炎性體、IL-1β、caspase-1表達水平,同時降低人腎小管上皮細胞焦亡率。(1)正常對照組:人腎小管上皮細胞中Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平較低。(2)缺氧/復氧(H/R)組:與正常對照組相比,缺氧復氧24h后,人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1活化增加,炎性因子IL-1β水平顯著升高(P0.05)。(3)缺氧/復氧+Nlrp3沉默腺病毒(H/R+si Nlrp3)組:與缺氧/復氧(H/R)組相比,缺氧復氧24h后,人腎小管上皮細胞焦亡升高程度(1.78%)顯著低于缺氧/復氧組(5.27%)(P0.05),人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1活化減少,炎性因子IL-1β水平顯著降低(P0.05),表明si Nlrp3腺病毒能有效地減輕缺氧復氧誘導的人腎小管上皮細胞焦亡,Nlrp3參與了缺氧復氧導致的人腎小管上皮細胞焦亡。3.缺氧復氧誘導人腎小管上皮細胞中Drp1、ROS表達上調(diào),Mdivi-1能抑制Drp1活化,減少ROS表達,同時降低Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平,并減少細胞焦亡。(1)正常對照組:人腎小管上皮細胞中Drp1、ROS水平較低。(2)缺氧/復氧(H/R)組:與正常組相比,缺氧復氧24h后,人腎小管上皮細胞Drp1表達顯著上調(diào)(P0.05),細胞中活性氧表達也顯著升高。(3)缺氧/復氧+Mdivi-1(H/R+Mdivi-1)組:缺氧/復氧(H/R)組,Mdivi-1未能明顯降低Drp1表達,但細胞中活性氧的表達顯著降低,人腎小管上皮細胞焦亡升高程度(1.8%)顯著低于缺氧/復氧組(5.27%)(P0.05),人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1活化減少,炎性因子IL-1β水平顯著降低(P0.05),提示抑制Drp1活化能有效減低細胞活性氧水平,降低人腎小管上皮細胞Nlrp3、caspase-1表達,Drp1參與了缺氧復氧誘導的人腎小管上皮細胞焦亡。結(jié)論1.細胞焦亡是缺氧/復氧誘導腎小管上皮細胞死亡的重要方式。2.缺氧/復氧通過上調(diào)Drp1,誘導Nlrp3炎性體表達和線粒體功能障礙,進而導致人腎小管上皮細胞發(fā)生炎癥反應和焦亡,是急性缺血性腎損傷的重要發(fā)生機制。
【關(guān)鍵詞】：動力相關(guān)蛋白1 Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 細胞焦亡 人腎小管上皮細胞 缺氧/復氧損傷
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 缺氧/復氧誘導人腎小管上皮Drp1、Nlrp3、活性氧、IL-1β 過表達致細胞焦亡15-31
• 2.1 材料與方法15-23
• 2.2 實驗結(jié)果23-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 抑制Drp1激活對缺氧/復氧誘導人腎小管上皮細胞焦亡的影響31-40
• 3.1 材料與方法31-37
• 3.2 實驗結(jié)果37-38
• 3.3 討論38-40
• 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻41-43
• 文獻綜述 線粒體功能障礙與焦亡在急性腎損傷中的相關(guān)研究及展望43-51
• 參考文獻48-51
• 碩士期間發(fā)表論文目錄51-52
• 致謝52

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