本文關(guān)鍵詞：活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：終末期腎臟疾病最為理想及有效的治療方法是腎移植。近年來，腎移植短期存活率有了明顯提高，而腎移植遠(yuǎn)期存活率仍然不容樂觀，移植腎慢性腎功能的喪失最終表現(xiàn)為腎纖維化。腎纖維化的主要病理學(xué)特征是腎小管萎縮同時(shí)伴有間質(zhì)纖維組織增生。間質(zhì)纖維組織大量累積是由肌成纖維細(xì)胞活化增生引起的，肌成纖維細(xì)胞的來源有多個(gè)學(xué)說，目前研究認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來源是腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT）。 有實(shí)驗(yàn)表明，T淋巴細(xì)胞可以直接破壞腎小管基膜，表現(xiàn)為“小管炎”，并且腎移植排斥時(shí)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，因此以前人們都認(rèn)為主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。然而，有研究表明，腎移植排異中，間質(zhì)也有巨噬細(xì)胞浸潤，尤其是Banff Ⅰb及以上級(jí)別的排異中間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤更多�；谝陨涎芯浚覀儼涯抗饧性诰奘杉�(xì)胞上，研究巨噬細(xì)胞是否在腎小管上皮細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮重要作用。 目的：本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）體外激活鼠巨噬細(xì)胞株J774，然后用其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E，觀察其能否促使NRK52E細(xì)胞發(fā)生EMT，并通過分析活化巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子成分，進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞在促進(jìn)EMT發(fā)生過程中的相關(guān)作用機(jī)制。 方法：鼠巨噬細(xì)胞(J774)分別在含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培養(yǎng)基中體外刺激24小時(shí)和48小時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的情況，并觀察用含2.5μg/ml LPS的DMEM培養(yǎng)基刺激24小時(shí)后J774的形態(tài)改變。將2.5μg/ml的LPS刺激24小時(shí)后的巨噬細(xì)胞消化離心，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀三次，收集第三次洗滌培養(yǎng)基做對照培養(yǎng)基。然后用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸巨噬細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，離心取上清做誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將NRK52E分為對照組和誘導(dǎo)組，對照組NRK52E的培養(yǎng)條件為對照培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最終濃度是5%，誘導(dǎo)組的培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最終濃度是5%。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)48小時(shí)的對照組和誘導(dǎo)組NRK52E細(xì)胞，用Real-Time PCR、Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測NRK52E細(xì)胞的上皮標(biāo)記物，如E-鈣粘蛋白（E-Ca），細(xì)胞角蛋白-19（CK19）和間充質(zhì)標(biāo)記物，如α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)LPS（2.5μg/ml）激活24小時(shí)的巨噬細(xì)胞J774上清中分泌的細(xì)胞因子。 結(jié)果： ELISA檢測結(jié)果表明，未刺激組巨噬細(xì)胞J774用含LPS濃度為0的DMEM培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中均未檢測到TNF-α和IL-6的存在。刺激組巨噬細(xì)胞J774用含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml LPS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中都檢測到有明確的TNF-α和IL-6分泌，表明不同濃度的LPS刺激J774作用24小時(shí)或48小時(shí)，都激活了J774巨噬細(xì)胞。但是用低濃度（1μg/ml）LPS刺激48小時(shí)與刺激24小時(shí)相比， J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，因此我們在后續(xù)激活巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，選擇LPS的刺激時(shí)間是24小時(shí)。當(dāng)LPS濃度為2.5μg/ml，刺激巨噬細(xì)胞J774作用24小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中含有較高濃度的TNF-α和IL-6，因此綜合考慮，，我們選擇LPS激活巨噬細(xì)胞的濃度為2.5μg/ml，刺激時(shí)間為24小時(shí)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，用LPS（2.5μg/ml）刺激J774作用24小時(shí)，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)J774由圓形伸出偽足，煎蛋樣貼壁生長。以上結(jié)果表明，LPS在體外激活了J774細(xì)胞。 分別在對照培養(yǎng)條件下和誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)NRK52E48小時(shí)后，與對照組相比，誘導(dǎo)組NRK52E形態(tài)發(fā)生變化，由連接緊密的鋪路石樣上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞間隙增大的長梭形間質(zhì)樣細(xì)胞。Real-Time PCR結(jié)果表明，與對照組細(xì)胞相比，誘導(dǎo)組NRK52E的上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19的mRNA表達(dá)量降低，是對照組NRK52E的29%，而間充質(zhì)標(biāo)記物α-SMA的mRNA表達(dá)量上調(diào)，是對照組NRK52E的5.6倍。 Western Blot結(jié)果表明，與對照組相比，誘導(dǎo)組NRK52E的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Ca蛋白的表達(dá)量明顯減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin和α-SMA的表達(dá)量都明顯增加。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果也顯示，與對照組相比，誘導(dǎo)組NRK52E細(xì)胞呈線狀表達(dá)的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Ca蛋白的表達(dá)量明顯降低。以上結(jié)果表明，與對照組相比，誘導(dǎo)組NRK52E的上皮細(xì)胞標(biāo)記物在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量都有顯著降低，同時(shí)其間葉細(xì)胞標(biāo)記物在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均增加，表明活化的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)NRK52E48小時(shí)后，使其發(fā)生了EMT。 與此同時(shí)，ESI質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，LPS刺激的巨噬細(xì)胞J774培養(yǎng)上清中，含有大量蛋白質(zhì)，大部分是與代謝有關(guān)的酶，除此之外，還檢測到幾種較明確的細(xì)胞因子，主要包括：補(bǔ)體C3，熱休克蛋白90（Hsp90），基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9），骨橋蛋白（Osteopontin），轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。 結(jié)論：LPS激活的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基能成功誘導(dǎo)NRK52E發(fā)生EMT，質(zhì)譜分析顯示LPS激活的大鼠巨噬細(xì)胞主要釋放的細(xì)胞因子有：補(bǔ)體C3，Hsp90，MMP-9，Osteopontin，TGF-β，IL-6，和TNF-α。巨噬細(xì)胞通過釋放上述因子誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 腎小管上皮細(xì)胞 上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 腎移植排異 腎纖維化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文對照表13-14
• 第1章 緒論14-19
• 1.1 文獻(xiàn)回顧14-17
• 1.1.1 腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)14-16
• 1.1.2 巨噬細(xì)胞在腎移植排斥中的作用16-17
• 1.2 引言17-19
• 第2章 材料和方法19-30
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 細(xì)胞株19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3 其他試劑20
• 2.2 主要儀器20-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 2.3.1 腎小管上皮細(xì)胞（NRK52E）和巨噬細(xì)胞（J774）的傳代、凍存與復(fù)蘇21-22
• 2.3.2 體外激活 J774（巨噬細(xì)胞株）并檢測激活后培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子22-23
• 2.3.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備和體外培養(yǎng) NRK52E 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組23-24
• 2.3.4 倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NRK52E 細(xì)胞形態(tài)改變24
• 2.3.5 Real-Time PCR 檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化狀態(tài)24-26
• 2.3.6 Western Blot 檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化狀態(tài)26-28
• 2.3.7 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化狀態(tài)28-29
• 2.3.8 ESI 質(zhì)譜檢測 LPS 激活的巨噬細(xì)胞 J774 培養(yǎng)上清29
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29-30
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-39
• 3.1 LPS 激活的 J774 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測結(jié)果30-31
• 3.2 LPS 刺激后 J774 細(xì)胞形態(tài)改變31-32
• 3.3 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo) NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化32-36
• 3.3.1 誘導(dǎo)后 NRK52E 細(xì)胞形態(tài)觀察32-33
• 3.3.2 Real-Time PCR 檢測 NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化結(jié)果33-34
• 3.3.3 Western Blot 檢測 NRK52E 細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化結(jié)果34-36
• 3.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測 NRK52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化結(jié)果36
• 3.4 ESI 質(zhì)譜檢測 J774 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白含量的結(jié)果36-39
• 第4章 討論39-43
• 第5章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 作者簡介51-52
• 致謝52

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 齊雋,閔志廉,朱有華,王亞偉,任吉忠,鄭軍華,徐丹楓,周梅生,劉玉杉,陸健,王立明,姚亞成;影響腎移植后人、腎長期存活的因素分析[J];中華器官移植雜志;2004年03期

2 齊雋,閔志廉,朱有華,劉玉杉,陸健,王立明,王亞偉,任吉忠,鄭軍華,徐丹楓,周梅生,姚亞成,高軼;腎移植術(shù)后存活影響因素分析(英文)[J];中華外科雜志;2002年04期

  本文關(guān)鍵詞：活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：400164