精子發(fā)生包括原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)形成、遷移、增殖和分化,性原細胞增殖、靜息和遷移,精原(干)細胞自我更新和分化,精母細胞減數(shù)分裂和精細胞變態(tài)形成精子一系列連續(xù)過程。其中任何一步發(fā)生異常,都會導(dǎo)致精子畸形、運動能力下降或數(shù)目減少(如臨床上常見的畸、弱、少精子癥),乃至無法形成(即臨床上常見的無精子癥),從而引發(fā)男性不育。男性不育影響約7%的男性。遺傳因素可能是生精障礙的主要原因,但在大多數(shù)病例中,其發(fā)病病因仍不清楚。本論文對一個巴基斯坦近親結(jié)婚后代發(fā)生男性不育的家系進行研究,以期揭示其不育的原因。父母為表兄妹結(jié)婚,生育四個兒子,其中三個不育,兩位為少弱精子癥患者,另一位是無精子癥患者。通過全外顯子組和Sanger測序,篩選到范可尼貧血(Fanconi Anemia,FA)核心復(fù)合物成分FANCM的一個移碼突變(c.1946_₁958del,p.P648Lfs*16)與不育癥共分離,認為是該家系不育患者的潛在致病突變。因為FANCM參與DNA鏈間交聯(lián)(interstrandcrosslink,ICL)損傷修復(fù),所以我們檢...

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 引言
    1.2 精子發(fā)生
        1.2.1 生殖細胞命運決定
        1.2.2 原始生殖細胞遷移和存活
        1.2.3 性原細胞增殖、靜息和遷移
        1.2.4 精原細胞自我更新和分化
        1.2.5 精母細胞減數(shù)分裂
        1.2.6 精子形成
    1.3 范可尼貧血與DNA鏈間交聯(lián)修復(fù)
        1.3.1 范可尼貧血
        1.3.2 DNA鏈間交聯(lián)產(chǎn)生原因和結(jié)果
        1.3.3 FA通路與鏈間交聯(lián)修復(fù)
        1.3.4 FA通路的其他作用
        1.3.5 FA通路與其他修復(fù)機制的交互作用
    1.4 FANCM的功能
        1.4.1 FANCM在FA通路的功能
        1.4.2 FANCM的獨特作用
        1.4.3 FANCM與Bloom綜合征的關(guān)系
        1.4.4 FANCM激活DNA損傷檢驗點而不依賴FA通路
        1.4.5 FANCM在復(fù)制叉重塑中的作用
第2章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 小鼠信息
        2.1.2 細胞系及菌種
        2.1.3 質(zhì)粒載體
        2.1.4 引物序列
        2.1.5 抗體信息
        2.1.6 耗材及試劑
        2.1.7 實驗儀器
        2.1.8 溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 病例收集
        2.2.2 全外顯子組測序
        2.2.3 外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體斷裂分析
        2.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.6 構(gòu)建FANCM^-/-穩(wěn)定的293T細胞系
        2.2.7 外源導(dǎo)入FANCM回補內(nèi)源FANCM敲除實驗
        2.2.8 免疫熒光
        2.2.9 Western Blot
        2.2.10 RNA抽提
        2.2.11 RT-PCR
        2.2.12 基因敲除小鼠制備
        2.2.13 小鼠生育力檢測
        2.2.14 睪丸組織包埋及切片
        2.2.15 組織切片蘇木精伊紅染色(HE)
        2.2.16 組織切片免疫熒光染色
        2.2.17 小鼠精母細胞鋪展及染色
        2.2.18 BrdU染色
        2.2.19 TUNEL檢測
        2.2.20 精子計數(shù)
        2.2.21 精原細胞中期染色體斷裂分析
        2.2.22 統(tǒng)計學(xué)分析
第3章 實驗結(jié)果及討論
    3.1 實驗結(jié)果
        3.1.1 巴基斯坦近親結(jié)婚家系中男性不育的臨床表型
        3.1.2 巴基斯坦家系不育患者中篩選并確定FANCM純合移碼突變
        3.1.3 FANCM突變導(dǎo)致患者染色體斷裂修復(fù)缺陷但不導(dǎo)致骨髓衰竭
        3.1.4 FANCM突變功能缺失損害FA通路
        3.1.5 FANCM突變降低細胞存活率
        3.1.6 Fancm△^C/△C
小鼠無骨髓衰竭
        3.1.7 Fancm△^C/△C
雄性小鼠生育力降低
        3.1.8 Fancm△^C/△C
雄性小鼠精子發(fā)生異常
        3.1.9 Fancm△^C/△C
雄性小鼠出生前后生殖細胞增殖減少
        3.1.10 FANCM突變與精子變形階段DNA斷裂修復(fù)
    3.2 討論
參考文獻
攻讀博士期間的主要學(xué)習(xí)成果
致謝
附錄1 預(yù)測突變的有害性的軟件列表



本文編號：3781399

boshi