本文關(guān)鍵詞：骨化三醇對TNF-α刺激的人腎小管上皮細(xì)胞Fractalkine的表達(dá)及其趨化作用的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:炎性細(xì)胞浸潤是直接導(dǎo)致腎臟炎癥發(fā)生發(fā)展的重要因素,Fractalkine作為第一個被人們發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面的趨化因子,能有效介導(dǎo)單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞黏附和趨化。Fractalkine與其特異性受體—CX3CR1介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的黏附以及趨化,與機(jī)體多種生理病理過程相關(guān)。TNF-α是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子,生理情況下在抵抗炎癥、促進(jìn)修復(fù)等方面具有重要作用,但是在病理情況下則會破壞免疫平衡導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生損傷。骨化三醇(1,25-(OH)2D3),作為維生素D3的活性形式不僅在體內(nèi)的鈣磷代謝中發(fā)揮著重要的作用,同時在免疫調(diào)節(jié)中也起著重要的作用。因此,圍繞炎癥狀態(tài)下fractalkine在腎損傷的發(fā)病機(jī)制和防治方面的研究近年來備受重視。本實(shí)驗擬通過TNF-α干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞(Human kidneyproxiamal tubular cells-2,HK-2)建立腎臟炎癥損傷的模型,研究腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)上的趨化因子fractalkine的表達(dá)的變化以及其對單核細(xì)胞THP-1的趨化作用的影響。在此基礎(chǔ)上再加入骨化三醇進(jìn)行干預(yù),探討骨化三醇對于TNF-α刺激后的HK-2腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法:1細(xì)胞培養(yǎng):人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2和人單核細(xì)胞細(xì)胞株THP-1是本院病原生物與免疫學(xué)教研室保存細(xì)胞株。(1)HK-2用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的D-MEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%~90%融合度時,繼續(xù)用體積分?jǐn)?shù)為0.05%FBS的D-MEM/F-12培養(yǎng)基培育24 h。設(shè)計實(shí)驗并分組:(1)正常細(xì)胞培養(yǎng)組(2)TNF-α干預(yù)組:40 ng/ml TNF-α干預(yù)不同時間點(diǎn)(0、1、6、12、24、48 h)后檢測HK-2細(xì)胞fractalkine的表達(dá);不同濃度的TNF-α(0、10、20、40 ng/m L)干預(yù)24 h后檢測HK-2細(xì)胞fractalkine的表達(dá)。(3)骨化三醇作用組:40 ng/ml TNF-α作用HK-2細(xì)胞24 h后,用不同濃度梯度(10-9 mol/L、10-10 mol/L、10-11 mol/L)的骨化三醇作用12 h檢測HK-2細(xì)胞fractalkine的表達(dá)。(2)THP-1細(xì)胞用RMPI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。?正常對照組:在下室僅加入無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,觀察THP-1的隨機(jī)移動?單純TNF-α組:僅在下室加入含TNF-α的無血清培養(yǎng)基觀察THP-1的移動。?未刺激組:未受到TNF-α刺激的HK-2細(xì)胞對于THP-1的趨化作用。?TNF-α實(shí)驗組:觀察用TNF-α干預(yù)后的HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化作用的影響。?Fractalkine中和抗體組:加入(1 ng/m L,5ng/m L)中和抗體后觀察HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化作用的影響。?骨化三醇實(shí)驗組:加入10-9 mol/L骨化三醇后觀察HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化作用的影響。上述每組實(shí)驗均設(shè)3~5個復(fù)孔,并重復(fù)3次實(shí)驗。2采用MTT法檢測TNF-α以及骨化三醇干預(yù)后對于HK-2細(xì)胞活力的影響。3采用Annexin V-FITC/PI流式法分析TNF-α以及骨化三醇對各實(shí)驗組人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的凋亡率的影響。4采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(enzyme-linked immnosorbent assay,ELISA)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中fractalkine的含量。5采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)以及實(shí)時熒光定量PCR檢測經(jīng)不同干預(yù)后的各組細(xì)胞fractalkine的m RNA表達(dá)水平。6采用Western Blot法檢測經(jīng)不同刺激后的各組細(xì)胞fractalkine的蛋白的表達(dá)水平。7采用免疫熒光技術(shù)檢測經(jīng)TNF-α干預(yù)后fractalkine在HK-2細(xì)胞上的主要表達(dá)部位。8采用含聚碳酸酶微孔濾膜的Transwell裝置檢測各實(shí)驗組的HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化作用的影響。結(jié)果:1 TNF-α及骨化三醇干預(yù)后對于人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)存活率有顯著的影響。TNF-α對HK-2細(xì)胞的存活率有著時間與劑量效應(yīng)的影響。隨著TNF-α使用的濃度以及時間的增加,HK-2細(xì)胞的存活率隨之降低,與空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在TNF-α干預(yù)后加入不同濃度的骨化三醇則發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率逐漸上升,在10-9 mol/L時,HK-2細(xì)胞增殖最明顯,與TNF-α組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2骨化三醇對經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡的影響經(jīng)TNF-α刺激的HK-2細(xì)胞凋亡率明顯升高,與空白對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在此基礎(chǔ)上使用不同濃度的骨化三醇作用一定的時間后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK-2細(xì)胞的凋亡率顯著下降,與TNF-α刺激組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在10-9 mol/L時,HK-2細(xì)胞凋亡率下降最明顯。3骨化三醇對經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)上清液fractalkine含量的影響經(jīng)TNF-α干預(yù)的HK-2細(xì)胞上清液中的fractalkine的含量較空白對照組升高(P0.05)。經(jīng)不同濃度梯度的骨化三醇作用后,HK-2細(xì)胞上清液中的fractalkine的含量所有降低,與TNF-α刺激組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4 TNF-α干預(yù)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)后呈時間和劑量依賴性上調(diào)fractalkine m RNA和蛋白的表達(dá)。檢測不同濃度的TNF-α作用于HK-2細(xì)胞24 h后,fractalkine的表達(dá)量隨著TNF-α使用劑量的增加而逐漸增加。未受到TNF-α刺激的HK-2細(xì)胞僅表達(dá)少量的fractalkine。同樣的,用40 ng/ml的TNF-2誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)fractalkine的表達(dá)量具有一定的時間效應(yīng)。其表達(dá)量隨著時間的增加逐漸增多,正常組的HK-2細(xì)胞僅表達(dá)少量的fractalkine。與正常組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5骨化三醇具有逆轉(zhuǎn)TNF-α對于人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的刺激作用,可下調(diào)HK-2細(xì)胞上fractalkine m RNA和蛋白的表達(dá),并上調(diào)HK-2細(xì)胞VDR的m RNA和蛋白的表達(dá)。40 ng/ml TNF-α作用HK-2細(xì)胞24 h后,用不同濃度梯度的骨化三醇再作用12 h后,檢測HK-2細(xì)胞fractalkine的m RNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)與TNF-α單純刺激組比較,fractalkine的表達(dá)量明顯降低(P0.05)。同時,對HK-2細(xì)胞上的骨化三醇的相應(yīng)受體VDR檢測發(fā)現(xiàn),TNF-α下調(diào)HK-2細(xì)胞的VDR m RNA和蛋白的表達(dá)(P0.05),而骨化三醇可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對于HK-2細(xì)胞的刺激作用,上調(diào)HK-2細(xì)胞VDR的m RNA和蛋白的表達(dá)(P0.05)。6 Fractalkine的亞細(xì)胞定位主要位于人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的細(xì)胞膜上用TNF-α對HK-2細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),以未受到TNF-α作用的HK-2細(xì)胞作為對照,在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要分布在HK-2細(xì)胞的細(xì)胞膜部位,說明fractalkine的亞細(xì)胞主要位于細(xì)胞膜上面。7經(jīng)TNF-α干預(yù)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)對THP-1細(xì)胞的趨化作用增強(qiáng),加入中和抗體以及骨化三醇后,其趨化作用減弱。正常對照組以及單純TNF-α組未見到遷移的THP-1細(xì)胞。未刺激的HK-2細(xì)胞對于THP-1細(xì)胞有較弱的趨化作用,與正常對照組及單純TNF-α組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TNF-α刺激24 h組的HK-2細(xì)胞對于THP-1細(xì)胞的趨化作用有所增強(qiáng),與前三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。fractalkine中和抗體組的HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化產(chǎn)生了抑制作用,濃度越高的中和抗體抑制趨化作用越明顯,與TNF-α組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。骨化三醇干預(yù)組的HK-2細(xì)胞對THP-1細(xì)胞的趨化作用有所減弱,與TNF-α組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 TNF-α刺激HK-2腎小管上皮細(xì)胞后上調(diào)fractalkine的表達(dá)并具有時間和劑量依賴性,fractalkine的表達(dá)位點(diǎn)主要在細(xì)胞膜上。2骨化三醇可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對fractalkine的上調(diào)作用,上調(diào)的fractalkine使HK-2細(xì)胞對于THP-1細(xì)胞的趨化作用增強(qiáng)而fractalkine中和抗體和骨化三醇則減弱其趨化作用。提示骨化三醇對于腎小管的炎癥性損傷具有一定的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：骨化三醇 腫瘤壞死因子TNF-α 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 單核細(xì)胞THP-1 趨化因子Fractalkine 炎癥
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-33
• 結(jié)果33-36
• 附圖36-47
• 附表47-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 綜述 CX3CL1（Fractalkine）/CX3CR1的生物學(xué)活性及其在疾病中的炎性作用57-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68

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