目的:腎細胞癌是世界上最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其基因?qū)W和細胞學(xué)的改變尚未被探索清楚。我們通過TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫信息查詢,找到腎透明細胞癌增殖相關(guān)的數(shù)個備選基因,并通過生物信息學(xué)方法縮小選定基因范圍,最終我們選定ERCCL6（excision repair cross-complementation group 6like）作為研究的目的基因,通過生信學(xué)分析ERCC6L可能與腎細胞癌的發(fā)展有關(guān),這是基于ERCC6L在腎細胞癌組織中的表達增加,以及其可能與癌癥的相關(guān)性。研究方法:通過28個癌/癌旁組織對照的腎細胞癌標本的分析,我們分析發(fā)現(xiàn)癌組織中ERCC6L的mRNA表達表達量明顯升高,在含有150個腎細胞癌樣本的組織芯片（TMA）中進行的免疫組織化學(xué)研究表明,ERCC6L的染色分數(shù)與腎癌的Fuhrman分級等級呈正相關(guān)。敲除ERCC6L的786-O和CAKI-1細胞的存活率明顯降低,同時凋亡也相應(yīng)地被誘導(dǎo)。在體實驗中我們也發(fā)現(xiàn)敲除ERCC6L表達的裸鼠種瘤增長更慢。結(jié)果:檢索TCGA數(shù)據(jù)庫,尋找腎透明細胞癌中表達異常的基因,TCGA數(shù)據(jù)... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分:TCGA數(shù)據(jù)庫腎癌基因的生物信息學(xué)分析與篩選
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 臨床標本
        2.2 細胞培養(yǎng)
        2.3 組織、細胞的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄
            2.3.1 主要試劑
            2.3.2 主要器材
            2.3.3 試驗步驟
        2.4 Mirco RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.5 Real-time PCR檢測
        2.6 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
            2.6.1 實驗材料
            2.6.2 實驗試劑及儀器
            2.6.3 實驗試劑的配制
        2.7 RNA干擾靶點設(shè)計及雙鏈DNA oligo制備
            2.7.1 基因信息
            2.7.2 RNA干擾靶點設(shè)計
            2.7.3 DNA oligo序列合成
            2.7.4 雙鏈DNA oligo制備
            2.7.5 電泳說明
        2.8 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建
            2.8.1 連接
            2.8.2 轉(zhuǎn)化
            2.8.3 引物
            2.8.4 PCR擴增
            2.8.5 陽性克隆測序結(jié)果分析
            2.8.6 質(zhì)粒抽提
        2.9 細胞增殖篩選
            2.9.1 目的病毒
            2.9.2 Celigo細胞計數(shù)檢測細胞增殖
            2.9.3 實驗試劑
            2.9.4 實驗步驟
        2.10 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析
            3.1.1 數(shù)據(jù)下載與拆分
            3.1.2 數(shù)據(jù)過濾與標準化
            3.1.3 差異基因列表獲取
        3.2 待研究基因篩選
            3.2.1 待研目的基因范圍的縮小
            3.2.2 表達與臨床預(yù)后分析
            3.2.3 增殖功能篩選
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分:ERCC6L在腎癌和細胞中的的表達量及細胞功能驗證
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞的RNA提取
        2.3 反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription PCR,RT-PCR）
        2.4 實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）
        2.5 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
        2.6 RNA干擾靶點設(shè)計及雙鏈DNA oligo制備
        2.7 RNA干擾慢病毒載體
        2.8 Western blot分析
            2.8.1 細胞總蛋白提取
            2.8.2 蛋白濃度測定
            2.8.3 SDS-PAGE電泳
            2.8.4 轉(zhuǎn)印
            2.8.5 封閉,抗體標記及ECL發(fā)光檢測
        2.9 FACS檢測ERCC6L基因消減對凋亡的影響
        2.10 MTT檢測ERCC6L基因消減對細胞增殖的影響
        2.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 ERCC6L在腎癌細胞系中的表達
        3.2 ERCC6L在腎癌組織及癌旁組織中的表達
        3.3 檢測mRNA水平ERCC6L基因消減效率
            3.3.1 qPCR檢測mRNA水平ERCC6L基因消減效率
            3.3.2 Western Blot檢測ERCC6L基因蛋白水平表達
        3.4 ERCC6L基因消減對細胞增殖的影響
            3.4.1 Celigo檢測ERCC6L基因消減對細胞增殖的影響
            3.4.2 MTT檢測ERCC6L基因消減對細胞增殖的影響
        3.5 FACS檢測ERCC6L基因消減對凋亡的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分:動物實驗驗證ERCC6L的生物學(xué)功能、腎癌組織芯片中的表達分析以及基因芯片和IPA通路分析及驗證
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
        2.2 RNA干擾靶點設(shè)計及雙鏈DNA oligo制備
        2.3 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建
        2.4 動物實驗
        2.5 組織芯片檢測
        2.6 免疫組化
        2.7 人基因表達譜芯片和IPA通路分析
        2.8 實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）
        2.9 Western blot分析
        2.10 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 動物實驗
        3.2 組織芯片
        3.3 人基因表達譜芯片和IPA通路分析
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述 腎癌發(fā)生發(fā)展的一些特征
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]1998-2008年中國腎癌發(fā)病趨勢分析[J]. 韓蘇軍,王棟,李長嶺,邢念增,張思維.  癌癥進展. 2018(10)



本文編號：3160291