本文關鍵詞：攜帶人源化的綠色熒光蛋白膀胱癌組織特異性報告基因腺病毒的構建及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構建攜帶人源化的綠色熒光蛋白(hrGFP,humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌組織特異性報告基因腺病毒載體Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,為檢測膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞提供了一種新的檢測方法。方法:根據(jù)圖譜選取BglII和PmeI兩種限制性內切酶分別對pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A進行分步酶切,pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后獲得IRES-hrGFP目的片段,pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后獲得PSCAE-UPII-E1A目的片段,對IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段進行膠回收。將回收得的兩個片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4連接酶連接,16°恒溫箱過夜,連接液轉化至DH5α感受態(tài)細胞中、涂板,16小時后選取陽性克隆,過夜搖菌,用菌液聚合酶鏈反應(PCR)、基因測序(IRES-hr GFP片段)鑒定新構建的穿梭質粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。將pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP用酶PmeI線性化后,電擊法轉化到含pAdEasy的BJ5183感受態(tài)細胞,轉化、涂板后選取陽性克隆,過夜搖菌,重組后的質粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP經(jīng)過酶切(PacI、BsphI)、菌液PCR鑒定正確后,通過脂質體lipfectamine2000轉染至包裝細胞HEK293,包裝成膀胱癌組織特異性報告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。結果:pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A經(jīng)過BglII和PmeI酶切后膠回收目的片段,將兩個目的片段用T4連接酶連接,形成新的穿梭質粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新構建的穿梭質粒pShuttle-PSCAEUPII-E1 A-IRES-hrGFP經(jīng)PCR鑒定和IRES-hr GFP基因測序鑒定,成功后利用細菌內同源重組法制備出組織特異性膀胱癌的腺病毒載體pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,經(jīng)酶切和PCR鑒定后,通過脂質體轉染至HEK293,熒光顯微鏡觀察到hrGFP基因的表達,包裝成報告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,經(jīng)四輪擴增純化后,測得病毒滴度為1.87×1011pfu/ml。結論:利用酶切從兩個穿梭質粒中相應的獲取所需的片段,通過連接反應形成新的pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。細菌內同源重組法成功構建出pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP重組腺病毒質粒。制備出的報告基因重組腺病毒為檢測膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞奠定了基礎。
【關鍵詞】：膀胱癌 循環(huán)腫瘤細胞 UPIIX啟動子 人源化綠色熒光蛋白 重組腺病毒 HEK293細胞
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 英文縮寫索引3-4
• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-14
• 材料和方法14-27
• 1.1 實驗材料14-16
• 1.1.1 質粒、載體和細菌菌株14
• 1.1.2 主要實驗試劑14
• 1.1.3 實驗試劑盒14
• 1.1.4 儀器及設備14-15
• 1.1.5 主要溶液及配制15-16
• 1.2 實驗方法16-27
• 1.2.1 引物設計與合成16-17
• 1.2.2 構建穿梭質粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP17-21
• 1.2.3 同源重組法制備重組質粒pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP21-25
• 1.2.4 細胞培養(yǎng)及包裝病毒25-27
• 結果27-29
• 2.1 穿梭質粒的鑒定pShuttle-PSCAE-UPII-E1A27
• 2.2 重組病毒質粒的鑒定pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP27-28
• 2.3 轉染48小時后、7 天后分別用熒光顯微鏡觀察hr GFP基因表達情況28-29
• 討論29-32
• 結論32-33
• 參考文獻33-37
• 文獻綜述37-44
• 綜述參考文獻42-44
• 在校期間的研究成果44-45
• 致謝45

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本文編號：310505