腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一。目前其發(fā)病率和死亡率都逐年升高。晚期腎癌治療手段有限、療效欠佳,主要的原因是其對放化療、免疫內(nèi)分泌治療等輔助治療均不十分敏感,靶向治療也僅在少數(shù)患者有部分作用。目前中晚期腎癌占大多數(shù),且術后常發(fā)生腎癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移,因此研究腎癌發(fā)生、發(fā)展的機制,同時尋求有效地抑制腎癌、改善其化療耐藥的現(xiàn)狀有十分重要的意義。microRNA （miR）是近些年來的研究熱點,它是一種非編碼的小分子單鏈RNA。不具備開放閱讀框架,并不真正有效地表達蛋白,但它可以有效地調(diào)節(jié)目的基因表達。其主要的方法是通過其種子區(qū)與特異性靶向基因的mRNA的3’UTR相結合,誘導靶基因mRNA水平下調(diào)或使其翻譯抑制,進而調(diào)控目的基因表達。目前越來越多的研究表明miR表達的異常是許多腫瘤共同的特征,它在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。miR-381和miR-424也不例外,盡管目前對miR-381和miR-424研究相比較少,但它們對多種腫瘤的影響很明確。miR在腎癌中的功能研究取得了一些進展,但腎癌中miR表達、功能及調(diào)節(jié)是相當復雜的,目前miR-381和miR-424在腎癌中研究尚未見報道。我... 

【文章來源】：中南大學湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
符號說明
前言
第一章 MIR-381和MIR-424在腎癌中表達特點及其靶基因分析
    1. 材料與設備
        1.1 細胞
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設備和耗材
    2. 方法
        2.1 生物信息學分析
        2.2 細胞培養(yǎng)
        2.3 細胞的凍存與復蘇
        2.4 MIR-381和MIR-424模擬物（MIMIC）的瞬時轉(zhuǎn)染
            2.4.1 miR-381和miR-424 mimic的制備
            2.4.2 細胞準備
            2.4.3 瞬時轉(zhuǎn)染模型物和對照核苷酸
        2.5 REAL TIME PCR
            2.5.1 細胞總RNA提取
            2.5.2 提取細胞小RNA（使用miR提取試劑盒）
            2.5.3 RNA濃度檢測
            2.5.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA
            2.5.5 Real time PCR檢測
        2.6 WESTERN BLOT實驗
            2.6.1 細胞總蛋白的提取
            2.6.2 樣本蛋白含量檢測
            2.6.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.6.4 轉(zhuǎn)膜
            2.6.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.6.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果
        2.7 雙熒光素酶報告基因分析
            2.7.1 實驗分組：本實驗分為如下各組分別轉(zhuǎn)染：實驗對照組、無義序列組（miR-NC）、轉(zhuǎn)染miR-381組和miR-424組
            2.7.2 WEE1（野生型）熒光素酶報告基因載體的構建
            2.7.3 WEE1突變體熒光素酶報告基因載體的構建
            2.7.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-381和miR-424對靶基因WEE1的直接調(diào)控作用
    3. 結果
        3.1 MIR-381和MIR-424靶基因的生物信息學分析
        3.2 MIR-381和MIR-424與靶基因的RNA二級結構分析
        3.3 MIR瞬時轉(zhuǎn)染效率測定
        3.4 MIR-381和MIR-424及其靶基因WEE1的表達
        3.5 腎癌細胞株中WEE1蛋白的表達及其與MIR-381和MIR-424表達水平的相關分析
        3.6 熒光素酶報告基因活性檢測分析MIR-381和MIR-424與WEE1靶向關系
    4 討論
    5 小結
第二章 MIR-381和MIR-424對腎癌細胞株細胞生物學功能影響及其機制研究
    1 材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設備
    2 方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞的凍存與復蘇
        2.3 MIR-381和MIR-424模擬物（MIMIC）的瞬時轉(zhuǎn)染
            2.3.1 miR-381和miR-424 mimic的制備
            2.3.2 細胞準備
            2.3.3 瞬時轉(zhuǎn)染模型物和對照核苷酸
        2.4 MIR-381和MIR-424對786-0、ACHN和HK-2細胞的MTT抑制實驗
        2.5 細胞周期的檢測
        2.6 細胞凋亡分析
        2.7 熒光酶標儀檢測CASPASE3/7酶的活性
        2.8 WESTERN BLOT實驗
            2.8.1 細胞總蛋白的提取
            2.8.2 樣本蛋白含量檢測
            2.8.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.8.4 轉(zhuǎn)膜
            2.8.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.8.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果
    3 結果
        3.1 MTT法檢測在不同時間點轉(zhuǎn)染MIR-381組和MIR-424對腎癌細胞及腎小管上皮細胞的生存率的影響
        3.2 CASPASE-3/7活性檢測分析在不同時間點轉(zhuǎn)染MIR-381和MIR-424對腎癌細胞及腎小管上皮細胞的CASPASE-3/7活性的影響
        3.3 細胞凋亡檢測分析MIR-381和MIR-424對腎癌細胞及腎小管上皮細胞的細胞凋亡的影響
        3.4 MIR-381和MIR-424對腎癌細胞786-0細胞周期的影響
        3.5 MIR-381和MIR-424對腎癌細胞影響的機制分析
            3.5.1 過表達miR-381和miR-424可抑制靶基因WEE1表達并促進有絲分裂
            3.5.2 過表達miR-381和miR-424可抑制細胞周期“分子開關”Cdc2磷酸化
            3.5.3 過表達miR-381和miR-424可調(diào)控細胞凋亡
            3.5.4 過表達miR-381和miR-424抑制Cdc2磷酸化不依賴于MYT1和Cdc25途徑
    4 討論
    5 小結
第三章 MIR-381增強5-FU在腎癌細胞株中化療敏感性及其機制研究
    1 材料
        1.1 細胞株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設備
    2 方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞的凍存與復蘇
        2.3 MIR-381模擬物（MIMIC）的瞬時轉(zhuǎn)染
            2.3.1 miR-381 mimic的制備
            2.3.2 細胞準備
            2.3.3 瞬時轉(zhuǎn)染miR-381 mimics和對照核苷酸
        2.4 MIR-381和5-FU對786-0、ACHN和HK-2細胞的MTT抑制實驗
            2.4.1 操作步驟
        2.5 WEE1 SIRNA轉(zhuǎn)染和回復實驗
        2.6 細胞周期的檢測
        2.7 流式細胞儀細胞凋亡分析
        2.8 熒光酶標儀檢測CASPASE3/7酶的活性
        2.9 WESTERN BLOT實驗
            2.9.1 細胞總蛋白的提取
            2.9.2 樣本蛋白含量檢測
            2.9.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.9.4 轉(zhuǎn)膜
            2.9.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.9.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果
    3 結果
        3.1 MTT法檢測在不同時間點轉(zhuǎn)染MIR-381對不同的5-FU濃度作用下的腎癌細胞及腎小管上皮細胞的生存率的影響
            3.1.1 轉(zhuǎn)染miR-381對不同的5-FU濃度作用下上述細胞的的生存率影響
            3.1.2 聯(lián)合應用5-FU和轉(zhuǎn)染miR-381在不同時間點上述細胞的的生存率影響
            3.1.3 轉(zhuǎn)染miR-381明顯下調(diào)786-0細胞5-FU的IC50（半抑制濃度）
        3.2. IR-381和5-FU對腎癌細胞及腎小管上皮細胞的CASPASE-3/7活性的影響
        3.3 細胞凋亡檢測分析MIR-381和5-FU對786-0細胞凋亡的影響
        3.4 MIR-381和5-FU對腎癌細胞786-0細胞周期的影響
        3.5 WEE1回復實驗及MIR-381增敏5-FU的機制
    4 討論
    5 小結
結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間主要研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]細胞周期中G1/S檢驗點的研究進展[J]. 舒麗娟.  中國醫(yī)學工程. 2012(07)
[2]miRNA調(diào)控EMT與口腔癌化療耐藥關系的研究進展[J]. 張斌,黃洪章.  中國口腔頜面外科雜志. 2011(05)
[3]多基因遺傳性腫瘤不同階段轉(zhuǎn)錄組學調(diào)控規(guī)律及其分子機制[J]. 李夏雨,沈守榮,武明花,李小玲,熊煒,盧建紅,周鳴,馬健,向娟娟,曾朝陽,向波,周艷宏,肖嵐,周厚德,范松青,李桂源.  中南大學學報(醫(yī)學版). 2011(07)
[4]轉(zhuǎn)移性腎癌藥物靶向治療的研究進展[J]. 穆家貴,王春陽,倪少濱.  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2011(11)
[5]WEE1與肝癌的關系[J]. 呂慧,楊玉秀,張立達,白陽秋.  世界華人消化雜志. 2011(14)
[6]miRNA與干細胞的生物學行為[J]. 張自強,劉玉梅,鄧雯,呂瓊霞.  中國組織工程研究與臨床康復. 2011(10)
[7]IL-2聯(lián)合5-氟尿嘧啶治療晚期腎癌50例療效觀察[J]. 鄒火生,黃裕清,李健,黃敏志.  昆明醫(yī)學院學報. 2010(12)
[8]胃癌與癌旁組織miRNA差異表達譜的研究[J]. 張岱,王振寧,羅陽,徐巖,劉彥山,楊威,張學.  醫(yī)學分子生物學雜志. 2010 (04)
[9]miRNA介導腫瘤生物學行為改變的研究進展[J]. 陳勇,左靜,劉巍.  中國腫瘤生物治療雜志. 2010(01)
[10]外周血miRNA作為腫瘤標志物的研究進展[J]. 萬菁.  腫瘤. 2009(06)



本文編號：3020250