腎小球疾病是威脅全球人類健康的公共衛(wèi)生問題,給家庭及社會帶來巨大的經濟壓力,是當今研究的前沿熱點和重點方向。足細胞結構和功能的損傷是多種腎小球疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。但至今人們對多種腎小球疾病尤其是足細胞結構損傷的發(fā)病機制、研究防治及相關干預的措施仍缺乏準確系統(tǒng)的了解,針對腎小球疾病的治療手段尚為稀少。因此,深入研究足細胞損傷的分子機制,明確誘導足細胞損傷的信號通路,將為腎小球疾病的防治提供新的思路和科學依據(jù)。α-parvin是一種極其重要的黏著斑蛋白,通過連接整合素和肌動蛋白骨架參與細胞骨架定位,調節(jié)細胞與細胞外基質粘附的信號轉導,從而在細胞粘附、伸展、存活等方面起著重要作用。然而,目前關于α-parvin在維持足細胞正常結構和功能中的作用仍無任何相關報道。為了探究α-parvin在足細胞中的作用,本研究運用Cre-Lox P重組酶系統(tǒng)成功構建足細胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvin Neph2c KO）。研究發(fā)現(xiàn)足細胞特異性敲除α-parvin會造成小鼠足細胞損傷（足細胞凋亡、裂孔隔膜蛋白組織異常）,進而導致腎小球衰竭（腎小管膨脹、糖原沉積、腎小球和腎間質纖維化）,最終導... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

腎臟結構示意圖[20]

哈爾濱工業(yè)大學工程碩士學位論文-7-結構不清，瘢痕形成。臨床上常見，多臟器功能損傷與衰竭表現(xiàn)；應及時有效地行透析來緩解中毒癥狀和嚴重尿毒癥并發(fā)癥的處理，提高生活與生存質量，延長生命。1.5α-parvin的生理結構α-parvin蛋白是黏著斑蛋白Parvin蛋白家族中的一員。大約2000年時，NikolopoulosandTuner在實驗室中從大鼠全DNA中分離和克隆出一個全新的F-actin和PaxillinLD1殘基結合蛋白，將其命名為Actopaxin[30]。Tu等人在利用酵母雙雜交篩選ILK的結合伙伴時，鑒定并克隆了一種新的含有兩個鈣結合蛋白同源結構域（Calpainhomologousdomain，CH1、CH2）的ILK結合蛋白，并由此命名為含有ILK結合蛋白的鈣同源結構域或CH-ILKBP（CalponinHomologydomain-containingILKBindingProtein）[31]。基于與α-actin結合區(qū)的序列同源性，Olski等鑒定并克隆了3種結構相關蛋白，分別命名為α、β和γ-parvin[32]。α-parvin在N端含有兩個鈣調節(jié)蛋白同源結構域（CH1、CH2）和核定位序列（NLS），是一種由N端多肽和2個鈣結合蛋白同源結構域（Calpainhomologousdomain、CH1、CH2）串聯(lián)而成的銜接蛋白。這種結構域使a-parvin能夠將絲狀肌動蛋白（F-actin）募集到其定位位點并與應力纖維結合。同時結合包括整合素連接激酶（Integrinlinkedkinase，ILK）和Paxilin在內的多種伴侶分子。并通過C端與ILK、PINCH形成PIP復合物，被招募到整合素富集黏附位點，與β-integrins的尾部結合，耦聯(lián)到細胞骨架激動蛋白上，接受胞外信號，調控細胞骨架的穩(wěn)態(tài)，激活信號通路，調控細胞的行為及形態(tài)發(fā)生過程，如圖1-2所示。圖1-2α-parvin蛋白的結構示意圖[33]α-parvin蛋白由N端多肽和兩個鈣調節(jié)蛋白同源結構域（CH1、CH2）串聯(lián)而成，主要通過

哈爾濱工業(yè)大學工程碩士學位論文-31-圖3-1成功構建足細胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）a)α-parvinNeph2cKO小鼠模型的構建策略。表達Neph2-Cre的小鼠與α-parvin2、3號外顯子兩側攜帶LoxP位點的小鼠雜交。b）鼠尾全基因組DNAPCR分析。α-parvin-/-基因條帶大小為502bp，而α-parvinflox/flox的條帶大小為636bp。Cre基因條帶大小為412bp。c）α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠離體足細胞α-parvin蛋白免疫印跡分析。d）對α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠進行腎切片α-parvin蛋白和Nephrin蛋白免疫雙熒光染色。標尺10μm。上面版中白框所選定區(qū)域的放大圖如下面版的圖像表示。圖b-d代表3個獨立的實驗。E=Exon；fl=flox；WT=wild-type。3.3本章小結由于全身性敲除α-parvin會導致小鼠胚胎致死，因而我們選定足細胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）來探究α-parvin在腎小球足細胞中的作用。利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)（Neph2-Cre）錨定α-parvin基因2、3號外顯子得到α-parvinNeph2cKO小鼠。經過鼠尾基因組DNAPCR分析實驗驗證所有小鼠的出生均遵循孟德爾遺傳定律且LoxP序列及Cre序列均插入正確。之后我們提取了原代足細胞進行了蛋白免疫印跡實驗驗證了小鼠腎臟足細胞中α-parvin蛋白的敲除，除此以外我們利用免疫熒光標簽染色證實α-parvinNeph2cKO小鼠足細胞中α-parvin蛋白的敲除，上述結果綜合表明我們成功構建了足細胞特異性敲除α-parvin小鼠。


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