發(fā)布時間：2017-04-10 09:25

  本文關鍵詞：miRNA-92a作用EBAG9基因調控前列腺癌增殖機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究前列腺癌細胞中的micro RNA-92a對EBAG9基因的表達及其對前列腺癌細胞增殖的調控機制。方法:應用micro RNA靶基因數據庫預測軟件mi Randa、Target Scan、Pic Tar,預測mi RNA-92a中的靶基因,再應用mi Rwalk取交集基因中210個基因,從中篩選與腫瘤相關的10個靶基因,通過往前列腺癌細胞系PC3中轉染mi RNA-92a的模擬物mimic、抑制物inhibitor和其各自的對照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,24h后分別提取其RNA,分別利用RT-q PCR方法檢測上述篩選的靶基因的m RNA轉錄表達情況,并對其結果進行統(tǒng)計學檢驗。根據統(tǒng)計學結果篩出靶基因EBAG9,再轉染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC,48h后提取總蛋白,利用Western blot檢測EBAG9的蛋白表達情況。結合Oncomine數據庫,收集天津市泌尿外科研究所40例前列腺癌及正常的前列腺增生組織,提取其RNA并行RT-q PCR,檢測EBAG9基因在腫瘤組織及正常組織的分布。用micro RNA數據庫預測軟件預測mi RNA-92a與EBAG9的潛在作用位點;設計EBAG9引物,利用PCR擴增其3’UTR片段,并分別用瓊脂糖凝膠電泳鑒定;目的基因及帶有熒光的質粒分別使用限制性內切酶酶切,最后將質粒與目的基因連接,構建含有EBAG9的3’UTR熒光報告質粒;將質粒擴增進而獲取高濃度質粒,限制性內切酶酶切后行瓊脂糖凝膠電泳后予以驗證,使用基因測序進而驗證其正確性后;分別將含有EBAG9片段的重組質粒及mi RNA-192a表達質粒共轉染入293T細胞,后用熒光報告檢測系統(tǒng)檢測轉染后的熒光素酶活性。結果:1.用數據庫預測軟件mi Randa、Target Scan、Pic Tar、mi Rwalk,成功篩選出與腫瘤相關的10個靶基因。2.轉染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 24h后,RT-q PCR驗證各個實驗組EBAG9基因在m RNA水平上變化有顯著的統(tǒng)計學意義。3.轉染mi RNA-92a mimic、mi RNA-92a inhibitor和其各自的對照mi RNA-92a mimic NC、mi RNA-92a inhibitor NC 48h后的EBAG9基因表達蛋白電泳結果表明,分別抑制和增強PC3細胞的mi RNA-92a后,EBAG9基因蛋白水平與m RNA水平變化保持一致且具有顯著的統(tǒng)計學意義。4.相對于正常前列腺增生組織及細胞,EBAG9基因在前列腺癌細胞及組織中顯著高表達。5.成功構建EBAG9的野生型3’UTR區(qū)片段,并經瓊脂糖凝膠電泳驗證其正確性。6.成功構建含有野生型的EBAG9的3’UTR區(qū)序列的重組質粒,并按正確方向與含有雙熒光素酶報告基因載體成功鏈接,擴增獲得高濃度質粒,酶切后的片段用瓊脂糖凝膠電泳驗證正確。7.使用大腸桿菌擴增野生型重組質粒得到高濃度質粒并經測序結果驗證正確。8.使用羅氏成功轉染重組質粒和mi R-92a表達質粒至293T細胞后,使用酶標儀測雙熒光素酶活性,結果顯示,相對于對照組,mi R-92a可以顯著降低含有EBAG9的3’UTR的重組質粒的熒光素酶的活性并具有顯著的統(tǒng)計學意義。此實驗顯示EBAG9為mi RNA-92a的靶基因。結論:1.EBAG9基因在前列腺癌細胞及組織中顯著高表達,通過臨床病理及資料分析,其與其腫瘤的分級、分期顯著正相關。2.mi RNA-92a作用EBAG9的3’UTR進而調控前列腺癌細胞的增殖。3.隨著研究的深入,可進一步尋找EBAG9基因的主要轉錄調節(jié)因子,進而探討其復雜的調控機制。
【關鍵詞】：前列腺癌 增殖 microRNA-92a 靶基因 調控 轉錄
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-13
• 前言13-19
• 研究現狀、成果13-18
• 研究目的、方法18-19
• 一、miRNA對靶基因EBAG9基因的影響19-44
• 1.1 對象和方法19-33
• 1.1.1 細胞系及組織標本19
• 1.1.2 模擬試劑及引物的合成19-20
• 1.1.3 常用耗材及試劑盒20-21
• 1.1.4 主要的設備及儀器21-22
• 1.1.5 實驗的試劑配置及過程22-25
• 1.1.6 實驗各種方法25-33
• 1.1.7 統(tǒng)計學結果的處理33
• 1.2 結果33-40
• 1.2.1 miR-92a的靶基因預測及結果33-34
• 1.2.2 轉染模擬物后靶基因mRNA水平上驗證34-37
• 1.2.3 蛋白印記電泳法Western blot檢測前列腺癌細胞系PC3細胞轉染模擬物之后的EBAG9基因的表達37-38
• 1.2.4 EBAG9基因在前列腺癌組織和BPH組織中的表達情況38-40
• 1.3 討論40-43
• 1.4 小結43-44
• 二、miRNA-92a對EBAG9基因調控機制的研究44-60
• 2.1 對象和方法44-53
• 2.1.1 實驗材料44-47
• 2.1.2 實驗方法及步驟47-53
• 2.1.3 統(tǒng)計學分析方法53
• 2.2 miRNA-92a對EBAG9基因調控機制的研究結果53-57
• 2.2.1 miRNA-92a與靶基因位點結合示意圖及目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結果53-54
• 2.2.2 酶切后的重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖54-55
• 2.2.3 含有EBAG9基因序列的片段及miRNA-92a過表達質粒測序結果55-56
• 2.2.4 miRNA-92a過表達質粒對含有EBAG93’UTR質粒雙熒光素酶抑制效果56-57
• 2.3 討論57-59
• 2.4 小結59-60
• 結論60-61
• 參考文獻61-64
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明64-66
• 綜述 MicroRNA在前列腺癌研究中的進展66-76
• 綜述參考文獻71-76
• 致謝76-77
• 個人簡歷77

  本文關鍵詞：miRNA-92a作用EBAG9基因調控前列腺癌增殖機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：296425