本文關(guān)鍵詞：FC-99通過(guò)抑制DCs分泌BAFF緩解狼瘡性腎炎的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種典型的自身免疫病,并伴隨有不同的臨床表現(xiàn)。狼瘡性腎炎(LN)是引起SLE患者死亡的主要原因。越來(lái)越多的證據(jù)表明,LN患者體內(nèi)有過(guò)度活化的循環(huán)B細(xì)胞和失去對(duì)自身抗原耐受性的B細(xì)胞,且自身抗體的沉積和多種免疫細(xì)胞的活化可以促進(jìn)LN的發(fā)病進(jìn)程。因此,B細(xì)胞被認(rèn)為是治療LN的重要靶點(diǎn)之一。B細(xì)胞活化因子(BAFF)是腫瘤壞死家族成員之一,對(duì)B細(xì)胞的增殖、活化及抗體分泌有重要作用。值得注意的是,可溶性的BAFF在SLE患者血清以及狼瘡小鼠器官中都是高表達(dá)。許多類(lèi)型的細(xì)胞包括單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)都可以產(chǎn)生BAFF,但是SLE患者BAFF被認(rèn)為主要來(lái)源于髓樣DCs。DCs在LN的早期被激活,活化的DCs可以通過(guò)分泌型的BAFF增強(qiáng)B細(xì)胞的功能,并參與LN疾病發(fā)展。重要的是,TLR4通路已經(jīng)被證明在LN的發(fā)病進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。TLR4通路活化后,DCs可以產(chǎn)生并分泌BAFF。前期我們的實(shí)驗(yàn)證明,小分子化合物FC-99具有保護(hù)實(shí)驗(yàn)性膿毒癥損傷和誘導(dǎo)性腸炎的作用。我們前期還發(fā)現(xiàn),FC-99可直接與IRAK4相互作用,而IRAK4在TLR4激活DCs活化中起著重要作用。因此,我們推測(cè)FC-99可以通過(guò)靶向IRAK4抑制DCs活化從而緩解LN。然而,關(guān)于FC-99能否影響DCs的活化及其BAFF的表達(dá)以及是否對(duì)SLE小鼠的LN具有療效果迄今未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究分析了FC-99緩解MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的效果；評(píng)價(jià)了FC-99對(duì)TLR4刺激后DCs分泌BAFF的影響；揭示了FC-99抑制DCs分泌BAFF的作用機(jī)制。(1)發(fā)現(xiàn)FC-99可緩解MRL/lpr狼瘡小鼠的狼瘡性腎炎：我們首先利用MRL/lpr狼瘡小鼠模型,探究了FC-99對(duì)狼瘡性腎炎疾病進(jìn)程的影響。發(fā)現(xiàn)FC-99可降低第20周的SLE小鼠尿蛋白的水平以及抑制1腎臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、IgG和C3c沉積以及炎性因子的產(chǎn)生；FC-99還可減少M(fèi)RL/lpr小鼠血清中自身抗體IgG、IgM和IgG2a的水平。這些結(jié)果表明,FC-99具有緩解MRL/lpr小鼠LN的作用。(2)發(fā)現(xiàn)FC-99可抑制LPS誘導(dǎo)的DCs活化及其BAFF產(chǎn)生：已知自身抗體主要是由B細(xì)胞產(chǎn)生,我們推測(cè)FC-99可以抑制B細(xì)胞活化。因此,我們檢測(cè)了FC-99處理組小鼠與空白對(duì)照組小鼠脾臟中B細(xì)胞的比例、活化及成熟的變化情況。結(jié)果表明,FC-99處理組小鼠脾臟總B細(xì)胞的百分比、活化B細(xì)胞的百分比以及成熟B細(xì)胞的百分比都顯著降低；FC-99還可減少成熟B細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD40和CD86的表達(dá)。以上結(jié)果表明,FC-99是通過(guò)抑制DCs產(chǎn)生BAFF減少自身抗體的產(chǎn)生來(lái)緩解狼瘡性腎炎。眾所周知,活化的DCs通過(guò)TLR4/IRAK4/NF-KB通路產(chǎn)生。為探究FC-99能否影響B(tài)AFF的產(chǎn)生,我們體外檢測(cè)FC-99對(duì)LPS誘導(dǎo)的DCs活化的影響。結(jié)果表明,FC-99不僅可以顯著降低細(xì)胞活化表面標(biāo)志CD40、CD86、MHCⅡ和CD80的表達(dá)還可以顯著降低BAFF的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步,由于BAFF可以促進(jìn)B細(xì)胞活化,我們推測(cè)FC-99預(yù)處理的DCs可以影響B(tài)細(xì)胞的增殖與活化。我們的結(jié)果顯示,FC-99預(yù)處理的DCs與B細(xì)胞共同培養(yǎng),可以顯著抑制B細(xì)胞增殖活化。而且,BAFF中和抗體可以明顯消除這種作用。更重要的是,FC-99既不能直接抑制B細(xì)胞活化也不能直接抑制B細(xì)胞增殖。以上結(jié)果表明,FC-99是通過(guò)減少BAFF產(chǎn)生,抑制B細(xì)胞活化。(3)發(fā)現(xiàn)FC-99通過(guò)抑制IRAK4磷酸化降低LPS誘導(dǎo)的DCs活化及其BAFF產(chǎn)生：我們前期發(fā)現(xiàn),FC-99可抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7的IRAK4磷酸化以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了檢測(cè)FC-99能否影響DCs的IRAK4磷酸化,DCs用100ng/mlLPS處理15分鐘,然后利用Western Blotting分析。接著我們檢測(cè)了下游NF-κB通路和MAPK通路的活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS可通過(guò)抑制IκBα磷酸化影響LPS誘導(dǎo)的DCs細(xì)胞NF-κB通路的活化。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn),FC-99可以通過(guò)減少p-38、P-JUK和P-ERK的磷酸化水平抑制LPS誘導(dǎo)的DCs細(xì)胞MAPK通路的活化。綜上所述,FC-99可抑制DCs的IRAK4磷酸化及其BAFF的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致B細(xì)胞活化的降低,從而緩解MRL/lpr狼瘡小鼠LN的發(fā)病進(jìn)程。我們的研究結(jié)果提示,FC-99可能是一個(gè)治療LN的潛在小分子化合物。
【關(guān)鍵詞】：FC-99 狼瘡性腎炎 樹(shù)突狀細(xì)胞 B細(xì)胞活化因子 B細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R593.242
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 FC-99緩解狼瘡性腎炎的發(fā)病進(jìn)程17-25
• 1.1 引言17-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象18
• 1.2.2 主要試劑18
• 1.2.3 主要儀器設(shè)備18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組19
• 1.3.2 FC-99治療小鼠狼瘡性腎炎19
• 1.3.3 小鼠尿蛋白濃度統(tǒng)計(jì)19
• 1.3.4 ELIAS檢測(cè)小鼠自身抗體沉積情況19-20
• 1.3.5 小鼠血清炎性因子的檢測(cè)20
• 1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR20-21
• 1.3.7 數(shù)據(jù)分析21
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析21-23
• 1.4.1 FC-99緩解MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎21-23
• 1.5 討論23-25
• 第三章 FC-99可抑制LPS誘導(dǎo)的DCS活化及其BAFF產(chǎn)生25-44
• 2.1 引言25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象25-26
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑26
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備26-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-32
• 2.3.1 流式分析27
• 2.3.2 FC-99的配置27
• 2.3.3 骨髓細(xì)胞的制備和髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)27-28
• 2.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力28-29
• 2.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs活化的表面標(biāo)志29
• 2.3.6 Q-PCR檢測(cè)髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)29-31
• 2.3.7 ELISA檢測(cè)DCs培養(yǎng)上清中BAFF的表達(dá)31-32
• 2.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析32
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-41
• 2.4.1 FC-99減少M(fèi)RL/lpr小鼠脾臟中B細(xì)胞的百分比,活化和成熟32-35
• 2.4.2 FC-99抑制MRL/lpr小鼠DCs活化35-37
• 2.4.3 FC-99的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DC活力的影響37-38
• 2.4.4 FC-99可抑制TLR4信號(hào)誘導(dǎo)的DCs活化38-39
• 2.4.5 FC-99可以抑制LPS-誘導(dǎo)的DCs分泌BAFF39-40
• 2.4.6 FC-99通過(guò)減少DCs分泌BAFF抑制B細(xì)胞活化40-41
• 2.5 討論41-44
• 第四章 FC-99通過(guò)抑制IRAK4磷酸化降低LPS誘導(dǎo)的DCS活化及BAFF產(chǎn)生44-51
• 3.1 引言44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象44-45
• 3.2.2 主要試劑45
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 3.3.1 Western blot45-47
• 3.4 數(shù)據(jù)分析47
• 3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 3.5.1 FC-99可以抑制IRAK4磷酸化水平48
• 3.5.2 FC-99對(duì)DCs細(xì)胞NF-κB通路和MAPK通路的影響48-49
• 3.6 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 附錄58-62
• 碩士期間科研成果62-63
• 致謝63-64

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本文編號(hào)：285981