目的:腎間質(zhì)炎癥纖維化是多種慢性腎病進(jìn)展為終末期腎病的共同病變過(guò)程和病理基礎(chǔ),其發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明,通常認(rèn)為是多因素綜合作用的結(jié)果,其中細(xì)胞死亡對(duì)炎癥反應(yīng)及后續(xù)纖維化發(fā)揮關(guān)鍵作用。壞死性凋亡是一種新型的細(xì)胞死亡模式,它具有細(xì)胞質(zhì)膜崩解、細(xì)胞器腫脹和線(xiàn)粒體功能喪失等細(xì)胞壞死的主要特征,同時(shí)又是一種可調(diào)控的,caspase非依賴(lài)的程序性細(xì)胞死亡。大量研究顯示壞死性凋亡能誘發(fā)、驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)。壞死性凋亡在急性胰腺炎、缺血性損傷、神經(jīng)退行性變等小鼠模型,以及臨床克羅恩病中發(fā)揮重要作用。此外,壞死性凋亡在多種腎臟疾病,如順鉑誘導(dǎo)的腎損傷、腎缺血再灌注、腎移植以及腎大部切除大鼠慢性腎纖維化等多種動(dòng)物模型中也起到關(guān)鍵作用。在本研究中,我們應(yīng)用單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)建立腎間質(zhì)炎癥纖維化模型,檢測(cè)小鼠UUO模型中是否存在壞死性凋亡,然后應(yīng)用壞死性凋亡特異性抑制劑necrostatins-1(Nec-1)進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)梗阻腎臟中炎癥和纖維化分子指標(biāo)表達(dá)情況,旨在探討抑制壞死性凋亡的腎臟保護(hù)作用及可能機(jī)制,為臨床腎病的治療提供新思路。方法:1.動(dòng)物模型建立健康雄性C57BL/6J小鼠按隨機(jī)區(qū)間法分為假手術(shù)組(Sham,n=6)、左側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO,n=6)、輸尿管結(jié)扎后經(jīng)Nec-1治療組(UUO+Nec-1,n=6)。UUO+Nec-1組自手術(shù)日起,每天給予Nec-1(1mg/kg/day)腹腔注射治療。Sham組除不結(jié)扎輸尿管外同模型組做相同處理。2.腎組織取材和指標(biāo)檢測(cè)術(shù)后7天處死小鼠,留取腎組織于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常規(guī)病理學(xué)染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè);剩余腎組織經(jīng)液氮速凍,用于提取腎皮質(zhì)總蛋白和總RNA。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)、受體相互作用蛋白3(receptorinteracting protein 3,RIP3)、混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-lβ(Interleukin-1β,IL-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α型肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原(collagen I,Col 1)的蛋白表達(dá),熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RIP1、RIP3、MLKL、TNF-α、IL-1β、MCP-1、TGF-β1、α-SMA、Col 1的基因表達(dá)。結(jié)果:1.Nec-1改善了UUO引起的腎臟病理?yè)p傷HE染色顯示,Sham組腎小管結(jié)構(gòu)正常,腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞增生。UUO組可見(jiàn)單核與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,部分近曲小管水腫或萎縮,部分腎小管明顯擴(kuò)張,管腔內(nèi)可見(jiàn)壞死脫落的上皮細(xì)胞。Nec-1治療后腎間質(zhì)炎性浸潤(rùn)減少,腎小管上皮細(xì)胞腫脹、擴(kuò)張和壞死程度減輕。Masson染色顯示,UUO組腎間質(zhì)有大量膠原纖維沉積,Nec-1治療明顯減輕了纖維化程度。2.Nec-1降低了UUO引起的壞死性凋亡相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的升高免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,Sham組RIP1在遠(yuǎn)曲小管胞漿中有少量表達(dá),RIP3和MLKL在小管胞漿中有微量表達(dá)。UUO組RIP1在大量遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核中都有表達(dá),RIP3多于近曲小管胞漿中呈強(qiáng)陽(yáng)性,而MLKL在部分小管細(xì)胞胞漿中大量表達(dá),部分小管胞核也有表達(dá)。Nec-1干預(yù)后,RIP1、RIP3和MLKL的陽(yáng)性信號(hào)均明顯減弱。Western blot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,UUO腎組織中RIP1、RIP3、MLKL蛋白及mRNA表達(dá)較Sham組顯著升高,給予Nec-1治療后,RIP1、RIP3、MLKL蛋白質(zhì)和mRNA水平明顯降低。3.Nec-1減少了UUO小鼠腎臟中炎癥因子的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,Sham組炎癥相關(guān)因子IL-1β、MCP-1于腎小管胞質(zhì)中有少量表達(dá),UUO組腎小管胞質(zhì)中二者表達(dá)顯著上調(diào),UUO+Nec-1組IL-1β和MCP-1在腎小管中的陽(yáng)性表達(dá)明顯降低。Western blot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,UUO組腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1蛋白質(zhì)及mRAN表達(dá)相較Sham組明顯上升,給予Nec-1治療后,三種炎癥因子的蛋白質(zhì)及mRAN水平顯著下調(diào)。4.Nec-1減輕了UUO小鼠腎臟間質(zhì)纖維化程度免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示,在Sham組腎間質(zhì)中,Col 1、TGF-β1有微量表達(dá),α-SMA僅表達(dá)于動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞中。UUO組,Col 1在間質(zhì)內(nèi)表達(dá)量顯著增加,α-SMA除表達(dá)于血管平滑肌外,還大量表達(dá)于腎間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞中,TGF-β1在腎小管胞漿中大量表達(dá)。UUO+Nec-1組Col 1、α-SMA和TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱。Western blot和Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,UUO組腎組織中Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA水平均較Sham組顯著升高,應(yīng)用Nec-1治療后,Col 1、α-SMA和TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)量明顯下降。結(jié)論:1.壞死性凋亡在單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎臟病理改變中起重要作用。2.壞死性凋亡特異性抑制劑Nec-1的腎臟保護(hù)作用可能是部分通過(guò)抑制炎癥和纖維化實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R692
【部分圖文】：

21圖 1 腎組織 HE 染色Fig. 1 HE staining of renal tissue (×400)am group B: UUO group C: UUO+Nec-1

圖 2 腎組織 Masson 染色Fig. 2 Masson staining of renal tissue (×400)A: Sham group. B: UUO group. C: UUO+Nec-1 group. D: Statistical analysisfor the percentage of renal fibrotic area.**P<0.01 vs. Sham group,##P<0.01 vs.UUO group.

23 3 各組小鼠腎組織 RIP1 免疫組化染色結(jié)nohistochemical staining for RIP1 in renal am group B: UUO group C: UUO+Nec-

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本文編號(hào)：2822837