【摘要】：背景糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病累及微血管所引起的主要并發(fā)癥之一,臨床上以進行性增多的蛋白尿和持續(xù)的腎功能損傷為重要特點,現(xiàn)已成為終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)最主要的原因之一。足細胞是構(gòu)成腎小球濾過屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),以足細胞異常為主的腎臟疾病,臨床上往往以大量蛋白尿為突出表現(xiàn)。目前研究認為,DN也是一種“足細胞病”,主要表現(xiàn)為足細胞肥大、足突融合、足細胞發(fā)生原位上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)以及足細胞數(shù)目的減少。當足細胞發(fā)生EMT時,將失去成熟足細胞原有的蛋白標記分子轉(zhuǎn)而表達間充質(zhì)細胞樣表型標志物。研究表明,體內(nèi)和體外的高血糖環(huán)境均可通過Snail誘導(dǎo)足細胞發(fā)生EMT,影響足細胞特異性蛋白的表達,擾亂足細胞骨架結(jié)構(gòu)及足突形態(tài),進而造成濾過屏障破壞甚至足細胞凋亡從而DN進展。肝再生磷脂酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)屬于非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員,首次被發(fā)現(xiàn)在直腸癌細胞中過表達且與直腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。腫瘤細胞的形態(tài)改變在其侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用,而參與腫瘤細胞形態(tài)改變的重要作用機制之一就是EMT,EMT使細胞間粘附性降低,極性逐漸喪失而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣狀態(tài),從而使細胞更具有侵襲、移動能力。近年來,PRL-3已被證實在多種腫瘤細胞中高度表達,且可通過Snail誘導(dǎo)腫瘤細胞EMT的發(fā)生。然而,PRL-3在腎臟組織中的表達是否受高糖環(huán)境的影響,其與足細胞EMT的發(fā)生是否相關(guān)暫無研究。目的探討PRL-3在腎臟組織中的表達情況、高糖環(huán)境對PRL-3表達量的影響以及PRL-3在足細胞EMT中的作用。方法(1)SPF標準條件下飼養(yǎng)db/db及db/m小鼠1-2周,監(jiān)測體重、血糖、尿點式總蛋白等相關(guān)指標,判斷糖尿病腎病小鼠是否造模成功。(2)于造模成功后的0周、4周、8周、12周隨機取3只小鼠取腎臟組織。以正常小鼠為對照組,免疫組織化學(xué)染色法檢測糖尿病腎病小鼠腎組織中PRL-3的表達情況;Western blot法再次檢測糖尿病腎病小鼠腎組織中PRL-3的表達量。(3)體外培養(yǎng)永生化人腎小球足細胞,分成四組后分別以正常糖濃度(5.6mmol/L葡萄糖)、低濃度葡萄糖(20mmol/L葡萄糖)、高濃度葡萄糖(40mmol/L葡萄糖)、高滲透壓(5.6mmol/L葡萄糖+34.4mmol/L甘露醇)為條件刺激24h。收集細胞提取蛋白,通過Western blot法檢測各組中PRL-3及足細胞EMT相關(guān)蛋白(Nephrin、Podocin、α-SMA)的表達量。(4)以預(yù)混后的Lipofectamine2000+特異性shRNA(3:1)轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染永生化人腎小球足細胞,以正常糖濃度組為對照,Western blot法檢測空載體轉(zhuǎn)染組、shRNA干擾組中PRL-3的表達量。(5)特異性shRNA沉默PRL-3表達后,分成四組:正常糖濃度組(5.6mmol/L葡萄糖)、高濃度葡萄糖組(40mmol/L葡萄糖)、shRNA+高糖組(shRNA干擾+40mmol/L葡萄糖)、空載體+高糖組(scramble序列+40mmol/L葡萄糖),共同培養(yǎng)24h后,Western blot法檢測足細胞EMT相關(guān)蛋白(Nephrin、Podocin、α-SMA)的表達量。結(jié)果(1)PRL-3主要表達在腎臟組織的腎小球部位,糖尿病腎病小鼠中PRL-3的表達量較正常小鼠顯著增加(P0.05),且具有時間依賴性。(2)與正常組相比,低濃度葡萄糖組及高濃度葡萄糖組中PRL-3的表達量顯著增高(P0.05),且該效應(yīng)具有濃度依賴性。高滲組中PRL-3的表達量較正常組無明顯改變。(3)與正常組相比,低濃度葡萄糖組及高濃度葡萄糖組中Nephrin、Podocin的表達量降低(P0.05),α-SMA的表達量增高(P0.05),該效應(yīng)具有濃度依賴性。高滲組中Nephrin、Podocin、α-SMA的表達較正常組均無明顯改變。(4)特異性shRNA轉(zhuǎn)染足細胞后,分子水平顯示PRL-3的表達量顯著減少(P0.05),空載體組中PRL-3的表達量較正常組無明顯變化。(5)特異性shRNA干擾PRL-3表達后,shRNA+高糖組中α-SMA的表達量較高糖組顯著減少,同時Nephrin、Podocin的表達量增加(P0.05)。而空載體+高糖組中PRL-3、Nephrin、Podocin、α-SMA的表達量與高糖組相比均無明顯的改變,排除scramble序列對實驗結(jié)果的影響。結(jié)論PRL-3主要在腎臟組織的腎小球部位表達,高糖環(huán)境可通過上調(diào)PRL-3的表達從而促進足細胞EMT的發(fā)生,抑制PRL-3的表達可減輕足細胞的損傷。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

18 2 糖尿病腎病小鼠腎臟組織中 PRL-3 的表達（Western blot 法注：Control:正常組；DN:糖尿病腎病組。*與對照相比，P<0.0糖條件下人足細胞中 PRL-3 的表達情況stern blot 結(jié)果顯示，與正常糖濃度組相比，低濃度葡萄糖組及 PRL-3 的表達量顯著增高（P<0.05），且該效應(yīng)具有濃度依中 PRL-3 的表達量較正常糖濃度組無明顯改變，排除了高達量的影響。見圖 3 。

糖尿病腎病小鼠腎臟組織中PRL-3的表達（免疫組化法）

圖 3 高糖條件下永生化人足細胞中 PRL-3 的表達情況: Control: 5.6mmol/L 葡萄糖；Hg20: 20mmol/L 葡萄糖；Hg40: 40mmol/L ；Mannitol: 5.6mmol/L 葡萄糖＋34.4mmol/L 甘露醇。*與對照相比，P<高糖條件下人足細胞中 Nephrin、α-SMA、Podocin 的

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本文編號：2793406