【摘要】：背景和目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者較為常見(jiàn)的一種并發(fā)癥,也是引起終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一。隨著人們對(duì)糖尿病腎病的研究及認(rèn)識(shí),現(xiàn)在普遍認(rèn)為糖尿病腎病是一種慢性炎癥性疾病,長(zhǎng)期微炎癥狀態(tài)使得腎臟腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)的改變,進(jìn)而引發(fā)微量蛋白尿乃至大量蛋白尿。現(xiàn)在不少學(xué)者認(rèn)為巨噬細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)是一種非受體型酪氨酸激酶,屬于Tec激酶家族。近期研究表明,Btk是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)等信號(hào)通路的重要的信號(hào)分子,參與并增強(qiáng)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并最終激活NF-κB和MAPKs信號(hào)通路,繼而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。同時(shí),Btk僅表達(dá)于除T淋巴細(xì)胞及組織漿細(xì)胞的髓系細(xì)胞,較TLR信號(hào)通路更有優(yōu)勢(shì),本研究探討B(tài)tk在糖尿病腎臟巨噬細(xì)胞激活及腎臟炎癥中的作用及分子機(jī)制,為糖尿病腎病的治療提供新的思路及措施。方法:第一部分:提取小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)成熟后采用細(xì)胞流式技術(shù)對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的Btk抑制劑PCI-32765對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響,接著采用Western blot法檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)和不同抑制劑濃度下p-Btk的相對(duì)表達(dá)量以?xún)?yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。把巨噬細(xì)胞分為:低糖組(LG),抑制劑對(duì)照組(LG+PCI-32765),高糖組(HG),抑制劑組(HG+PCI-32765),刺激相應(yīng)時(shí)間后收集細(xì)胞和上清,提取細(xì)胞m RNA及總蛋白。Transwell法觀察巨噬細(xì)胞的趨化功能;ELISA法檢測(cè)上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)i NOS,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65,IκB,p-IκB等蛋白的表達(dá);激光共聚焦法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的激活及NF-κB p65核轉(zhuǎn)移。第二部分:選取Btk全髓系敲除小鼠及同背景野生型小鼠各14只作為研究對(duì)象,糖尿病組注射50mg/kg.d STZ連續(xù)5天,一周后檢測(cè)各小鼠尾尖血糖,血糖≥16.7mmol/L則視為造模成功。該實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為:野生型小鼠7只作為正常對(duì)照組(WT,n=7),糖尿病小鼠組(Diabetic,n=7),Btk敲基因小鼠組(Btk-/-,n=7)和Btk敲基因糖尿病小鼠組(Btk-/-diabetic,n=7)。12周后檢測(cè)各小鼠體重、血糖、腎重,收集血、24小時(shí)尿及腎臟標(biāo)本。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)小鼠24小時(shí)尿蛋白排泄率;光鏡觀察小鼠腎臟病理變化;免疫組化方法檢測(cè)IL-1β,MCP-1,激光共聚焦法檢測(cè)CD68等;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-1β,MCP-1和TNF-α的表達(dá);Western blot檢測(cè)蛋白IL-1β,i NOS,TNF-α,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65的表達(dá)。結(jié)果:第一部分:細(xì)胞流式結(jié)果顯示F4/80和CD11b雙陽(yáng)性的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的94.5%,細(xì)胞的純度及成熟度均符合實(shí)驗(yàn)要求;實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化后選擇高糖的濃度為25mmol/L,PCI-32765的干預(yù)濃度為10-6mmol/L;Transwell趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖刺激的巨噬細(xì)胞趨化的數(shù)目明顯高于低糖組(P0.05),PCI-32765干預(yù)后細(xì)胞趨化數(shù)目較高糖組明顯下降(P0.05);實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,高糖組細(xì)胞IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA水平較低糖組細(xì)胞明顯上升(P0.05),抑制劑組與高糖組相比,三者的m RNA水平明顯下調(diào)(P0.05);ELISA結(jié)果顯示,高糖組細(xì)胞上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度較低糖組明顯升高(P0.05),與高糖組相比,抑制劑組IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度明顯下降(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,與低糖組相比,蛋白i NOS,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P0.05),抑制劑組與高糖組比,i NOS,p-Btk,p-ERK,p-NF-κB p65,p-IκB的表達(dá)明顯下降(P0.05),p-ERK,p-JNK的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P0.05);激光共聚焦結(jié)果顯示,高糖組巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志蛋白i NOS的表達(dá)和NF-κB p65核轉(zhuǎn)移較低糖組明顯升高,與高糖組相比,抑制劑組兩者的表達(dá)則有所下降。第二部分:與WT組小鼠相比,糖尿病小鼠血糖、糖化血紅蛋白、腎重/100g體重和24小時(shí)尿蛋白排泄率明顯改變(P0.05),與Diabetic組相比,Btk-/-diabetic組24小時(shí)尿蛋白排泄率明顯降低(P0.05),血糖、糖化血紅蛋白和腎重/100g體重未發(fā)生明顯改變;光鏡下,Diabetic組小鼠較正常組小鼠腎臟腎小球體積增大,基底膜增厚,系膜細(xì)胞增殖,Btk-/-diabetic組小鼠較Diabetic組有所改善;實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:Diabetic小鼠腎臟炎癥因子較正常組表達(dá)明顯升高(P0.05),Btk缺失后小鼠腎臟炎癥水平較糖尿病小鼠明顯下降(P0.05);免疫組化和激光共聚焦提示Diabetic小鼠腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加,隨著B(niǎo)tk敲除,腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少;Western blot結(jié)果顯示蛋白p-Btk,p-ERK,p-JNK,p-NF-κB p65,p-IκB在Diabetic組小鼠腎臟的表達(dá)較正常小鼠明顯升高(P0.05),較Diabetic組小鼠,Btk-/-diabetic小鼠腎臟中這些蛋白的表達(dá)明顯下降。結(jié)論:1在高糖刺激下,骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞激活,細(xì)胞內(nèi)p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB表達(dá)上調(diào),炎癥因子IL-1β,MCP-1,TNF-α表達(dá)增加;Btk敲除后抑制MAPK以及NF-κB信號(hào)通路激活,下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。2在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,糖尿病小鼠腎臟p-Btk表達(dá)明顯升高,24小時(shí)尿蛋白排泄率升高,腎小球出現(xiàn)肥大,基底膜增厚,外基質(zhì)沉積等病理改變,除此之外腎臟炎癥及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)激活增加,Btk敲除后該現(xiàn)象有所改善,提示Btk可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展;3糖尿病小鼠腎組織,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB的表達(dá)明顯上調(diào),炎癥因子IL-1β,TNF-α和MCP-1合成增加,Btk敲除后下調(diào)MAPK,NF-κB信號(hào)通路以及炎癥因子的表達(dá),提示Btk致糖尿病腎損傷發(fā)生的機(jī)制可能與MAPK以及NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān);
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【圖文】：

32髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的純度檢測(cè)糖對(duì) BMMs 活化的影響圖 2 結(jié)果所示，采用 Western blot 法檢測(cè)不同葡萄糖濃度對(duì)巨噬細(xì)胞其中使用甘露醇將各組滲透壓調(diào)整至一致。當(dāng)葡萄糖終濃度為 30mm胞活化的標(biāo)志蛋白 iNOS 表達(dá)達(dá)到高峰(P<0.05)，在此高糖濃度下蛋生磷酸化(P<0.05)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖終濃度定為 30mm

同濃度高糖對(duì) BMMs 活化的影響糖濃度為 5mmol/L 相比，*P<0.05制劑 PCI-32765 對(duì) BMMs 活性的影響CK-8 法檢測(cè)不同濃度的 Btk 抑制劑 PCI-32765 對(duì)巨噬細(xì)胞活性的見(jiàn)當(dāng) PCI-32765 的濃度在 10-8~10-5mM 范圍時(shí)，PCI-32765 對(duì)巨噬，當(dāng)濃度達(dá)到 10-4mM 時(shí)，PCI-32765 對(duì)高糖刺激的巨噬細(xì)胞的活)。

不同濃度高糖對(duì) BMMs 活化的影響萄糖濃度為 5mmol/L 相比，*P<0.05抑制劑 PCI-32765 對(duì) BMMs 活性的影響 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度的 Btk 抑制劑 PCI-32765 對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影見(jiàn)當(dāng) PCI-32765 的濃度在 10-8~10-5mM 范圍時(shí)，PCI-32765 對(duì)巨噬細(xì)，當(dāng)濃度達(dá)到 10-4mM 時(shí)，PCI-32765 對(duì)高糖刺激的巨噬細(xì)胞的活性05)。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 付威;姜英;王婷玉;張赫;董佳琦;萬(wàn)朋;;巨噬細(xì)胞極化與腫瘤的研究進(jìn)展[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2019年02期

2 廖成水;毛福超;程相朝;;巨噬細(xì)胞極化在微生物感染中的作用研究進(jìn)展[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2019年03期

3 徐曉偉;魏建超;劉珂;邵東華;李蓓蓓;曹瑞兵;陳溥言;馬志永;胡敬東;邱亞峰;;不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響[J];中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2019年02期

4 邢士剛;;巨噬細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2019年12期

5 程相朝;毛福超;;巨噬細(xì)胞極化形成的影響因素研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2019年06期

6 巢汝;黃靚;屈順林;張弛;;巨噬細(xì)胞能量代謝與動(dòng)脈粥樣硬化[J];生命的化學(xué);2018年03期

7 崔凡;穰真;王有為;楊戈;;AIDS患者巨噬細(xì)胞對(duì)白念珠菌的吞噬和滅活功能研究[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2017年04期

8 孟董超;王東;宋娟;盧彥珍;;巨噬細(xì)胞極化在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展[J];長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2017年02期

9 李雪巖;楊玉玉;陳君;;中藥抗巨噬細(xì)胞泡沫化的研究進(jìn)展[J];藥學(xué)與臨床研究;2017年05期

10 袁鋒;尚茹茹;張錦;溫婷;李?lèi)?ài)萍;劉曉紅;;巨噬細(xì)胞極化與動(dòng)脈粥樣硬化[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2015年22期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姚芳苡;黃自坤;傅穎媛;;人巨噬細(xì)胞極化相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜篩選及研究[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年

2 李枋;霏李杰;;扶正解毒方對(duì)共培養(yǎng)體系下腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型變化影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆青年中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)術(shù)論壇論文集[C];2015年

3 白力;張文蘭;竇晶莉;王永福;;組蛋白修飾與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系[A];第十屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)匯編[C];2015年

4 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細(xì)胞激活作用的研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

5 程相朝;毛福超;廖成水;;巨噬細(xì)胞極化形成的影響因素研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物微生態(tài)學(xué)分會(huì)第五屆第十三次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2018年

6 曾嬌;;巨噬細(xì)胞極化對(duì)炎癥性疾病的影響[A];第十三屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2018年

7 李小鵬;張倫理;;巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象與結(jié)核病的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)2014全國(guó)微生物學(xué)與免疫學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2014年

8 陳羅泉;萬(wàn)曉朋;韓泉;王青青;;白細(xì)胞介素27在巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用研究[A];浙江省免疫學(xué)會(huì)第十次學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2016年

9 馬曉媛;田李星;靳賀;梁華平;;創(chuàng)傷/燒傷后單核—巨噬細(xì)胞變化及調(diào)節(jié)措施研究進(jìn)展[A];2015第十一屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合災(zāi)害醫(yī)學(xué)大會(huì)、江蘇省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第二屆災(zāi)害醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議、中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志第二屆編委會(huì)會(huì)議暨2015江蘇國(guó)際醫(yī)療器械科技博覽會(huì)學(xué)術(shù)論文集[C];2015年

10 馬翠卿;胡光磊;尹曉琳;胡潔;楊建嶺;王秀榮;魏林;;A族鏈球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死而非凋亡[A];河北省免疫學(xué)會(huì)第六次免疫學(xué)大會(huì)資料匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 主持人 王建新;巨噬細(xì)胞的多面人生[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2015年

2 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細(xì)胞未必皆“惡人”[N];健康報(bào);2014年

3 張化;新技術(shù)有望延長(zhǎng)血小板保存期[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

4 張化;半乳糖可延長(zhǎng)血小板保存期[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

5 蘭克;以嘗試用巨噬細(xì)胞治癱瘓[N];科技日?qǐng)?bào);2000年

6 ;癌細(xì)胞能通過(guò)“別吃我”信號(hào)逃避巨噬細(xì)胞[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

7 記者 張家偉;巨噬細(xì)胞水平影響血壓高低[N];健康報(bào);2019年

8 記者 房琳琳;“別吃我”! 癌細(xì)胞還有第二種方式對(duì)巨噬細(xì)胞這樣說(shuō)[N];科技日?qǐng)?bào);2017年

9 本報(bào)記者 張曄 通訊員 蔡心軼 張翰文;肥胖傷肝？原來(lái)是巨噬細(xì)胞在作怪[N];科技日?qǐng)?bào);2016年

10 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細(xì)胞泡沫化抑制劑研究快步進(jìn)行[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 郭樂(lè);腸上皮細(xì)胞參與抗HIV的天然免疫機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2018年

2 張景博;ASC-J9對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎M2型巨噬細(xì)胞極化的影響及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2019年

3 吳婧婧;G蛋白偶聯(lián)受體激酶2調(diào)控M2巨噬細(xì)胞β2腎上腺素受體信號(hào)在肝細(xì)胞癌中的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

4 朱梅;高糖刺激巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體誘導(dǎo)腎臟損傷的作用與機(jī)制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

5 賈懿R

本文編號(hào)：2781366