【摘要】：研究背景長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是指序列長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、但無(wú)編碼蛋白功能的一類RNA。LncRNA在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá),并參與了對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。目前關(guān)于膀胱癌中LncRNA的研究尚不多,其可能的作用機(jī)制仍不清楚。目的了解膀胱癌中LncRNA的表達(dá)情況,探索LncRNA-linc00346對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并揭示其可能的作用機(jī)制。方法1.在6對(duì)膀胱癌及癌旁正常膀胱組織標(biāo)本中進(jìn)行基因芯片檢測(cè),觀察LncRNA的差異表達(dá)情況,采用qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果,并進(jìn)行基因功能和信號(hào)通路等生物信息學(xué)分析,構(gòu)建差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。2.根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,選出linc00346作為目標(biāo)LncRNA進(jìn)行深入研究。通過(guò)qRT-PCR在52例臨床膀胱癌組織標(biāo)本和膀胱癌T24、SW780細(xì)胞系中再次驗(yàn)證linc00346的差異表達(dá)情況。3.應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA技術(shù)沉默linc00346在膀胱癌T24和SW780細(xì)胞系中的表達(dá),然后進(jìn)行一系列細(xì)胞功能試驗(yàn),通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等來(lái)研究沉默linc00346表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響。4.通過(guò)Western blot檢測(cè)沉默linc00346后T24和SW780細(xì)胞系中PI3K/Akt通路PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)變化情況,并加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,初步探索linc00346影響膀胱癌細(xì)胞的機(jī)制。結(jié)果1.經(jīng)過(guò)基因芯片篩選,得到了差異表達(dá)LncRNA共2548條(FC值2.0),其中在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)的1539條,下調(diào)的1009條;明顯表達(dá)差異(FC值10)的LncRNA上調(diào)的有126條,下調(diào)的有103條。生物信息學(xué)分析顯示LncRNAs和rmRNAs之間存在著密切的共表達(dá)關(guān)系,并選出了在膀胱癌中顯著表達(dá)上調(diào)的linc00346進(jìn)行功能及機(jī)制研究。2.linc00346在膀胱癌組織中表達(dá)水平較其癌旁正常組織明顯上調(diào),膀胱癌T24和SW780細(xì)胞系中l(wèi)inc00346的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照的正常人膀胱上皮HUM-CELL-0046細(xì)胞系。3.CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Ki67免疫組化、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默linc00346可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)、Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默linc00346可以影響膀胱癌細(xì)胞周期,使腫瘤細(xì)胞停滯于G0/GI期,并加劇腫瘤細(xì)胞的凋亡;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示沉默linc00346能夠削弱膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。4.沉默linc00346能夠顯著降低PI3K、Akt的磷酸化水平,即減弱了PI3K/Akt通路的激活。聯(lián)合應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002時(shí),其對(duì)PI3K、Akt磷酸化的抑制作用更加顯著。結(jié)論1.膀胱癌組織中存在大量差異表達(dá)的LncRNAs,這些異常表達(dá)的LncRNAs可能與膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。2.linc00346在膀胱癌中表達(dá)顯著上調(diào),并且能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡、增加癌細(xì)胞侵襲性和腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。3.linc00346可能是通過(guò)激活PI3DK/Akt通路磷酸化來(lái)對(duì)膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生影響的。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

針信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理，目的是使芯片的基礎(chǔ)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)成同步一致，逡逑從而避免了因基礎(chǔ)熒光信號(hào)存在差別而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差或差錯(cuò)的情況發(fā)逡逑生。１２個(gè)樣本經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后繪制成箱線圖，如圖１－２所示，１２個(gè)樣逡逑本的芯片熒光信號(hào)強(qiáng)度一致，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比的可信度。逡逑Ｉ１０＇邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐Ｍ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐！邐ｉ逡逑１逡逑—邐灥W邐■逡逑－－逡逑Ｉ邐１邐Ｉ邐１邐Ｉ邐１邐１邐Ｉ邐Ｉ邐１邐？逡逑Ｉ邐１邐ｔ邐１邐瞻邐《邐？邐．邐Ｊ邐１邐Ｉ逡逑NNN邐NNN邐NNN邐NNN逡逑ｉｌｉｇｌｔｓｓｓｉｓ邋ｓ逡逑Ｓａｍｐｌｅ逡逑圖１－２芯片箱線圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｂｏｘ－ａｎｄ－ｗｈｉｓｋｅｒ邋ｐｌｏｔ邋ｆｏｒ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ逡逑然后檢測(cè)各樣本中ＬｎｃＲＮＡ表達(dá)譜的差異性（圖１－３）；將篩選得到的差異逡逑表達(dá)基因，通過(guò)聚類熱圖、散點(diǎn)圖及火山圖等直觀的圖形進(jìn)行展示。逡逑１９逡逑

圖１－３各樣本中ＬｎｃＲＮＡ表達(dá)譜差異逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋ＬｎｃＲＮＡ邋Ｃｈｉｐ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑①差異基因聚類熱圖（圖１－４）逡逑聚類熱圖是對(duì)樣本和基因各自分別進(jìn)行分級(jí)聚類之后，通過(guò)熱圖的形式來(lái)逡逑表現(xiàn)基因在不同樣本中的表達(dá)情況。橫坐標(biāo)是樣本名稱，樣本按照計(jì)算所得到逡逑的距離遠(yuǎn)近值來(lái)進(jìn)行排序；縱坐標(biāo)是探針號(hào)或基因名稱。因而聚類分析圖表示逡逑各組織樣本中ＬｎｃＲＮＡ的表達(dá)量差異越大，則它們所處的位置的間距就越遠(yuǎn)。逡逑２０逡逑

圖１－５各樣本ＬｎｃＲＮＡ表達(dá)散點(diǎn)圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ｓｃａｔｔｅｒ－ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ＬｎｃＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｓａｍｐｌｅｓ逡逑③火山圖（圖１－６）逡逑從基因芯片結(jié)果數(shù)據(jù)中篩選出顯著性差異表達(dá)的ＬｎｃＲＮＡ，需設(shè)定差異倍數(shù)逡逑（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ值）和ｔ－檢驗(yàn)得到的Ｐ－ｖａｌｕｅ值這兩個(gè)條件，火山圖可以展不出滿逡逑足上述兩條件的差異ＬｎｃＲＮＡ數(shù)目以及這些ＬｎｃＲＮＡ在同一平面內(nèi)的分布情況。逡逑在火山圖里，橫坐標(biāo)為ｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ邋Ｃｈａｎｇｅ），縱坐標(biāo)為－ｌｏｇｌＯ（Ｐ－ｖａｌｕｅ），基因表達(dá)逡逑的上調(diào)或下調(diào)用正負(fù)號(hào)表示。逡逑２２逡逑

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