發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 09:17

【摘要】：研究背景及目的：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見腫瘤,位于癌癥相關(guān)死亡率第六位,嚴(yán)重危害中老年男性健康。前列腺癌的發(fā)病率及死亡率存在很大的地域差異,在美國已成為發(fā)病率及死亡率第一位的惡性腫瘤,在亞洲國家前列腺癌的發(fā)病率仍處于較低水平。隨著社會(huì)人口的老齡化及診斷篩查技術(shù)的進(jìn)步,我國前列腺癌發(fā)病率在逐年提高,已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位,僅次于膀胱癌和腎癌。目前,對(duì)前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測(cè)及前列腺穿刺病理活檢,但因PSA具有診斷敏感性及特異性不高,不能判別進(jìn)展性和惰性前列腺癌等缺點(diǎn),從而導(dǎo)致不必要的前列腺穿刺活檢及前列腺癌的過度治療。因此,研究更有效的前列腺癌標(biāo)記物對(duì)提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個(gè)體化治療方案,減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義。前列腺癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。既往人們對(duì)前列腺癌發(fā)病機(jī)制的研究大部分集中于前列腺癌細(xì)胞,認(rèn)為前列腺癌的發(fā)生主要是前列腺上皮細(xì)胞基因突變的結(jié)果,上皮細(xì)胞癌基因激活和抑癌基因失活是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。目前認(rèn)為前列腺癌的形成是遺傳、炎癥、環(huán)境等多因素綜合作用的結(jié)果,涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括正常上皮細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變、上皮-間質(zhì)細(xì)胞的相互作用、腫瘤的生長(zhǎng)及局部侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。研究已證實(shí)腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)共同特征,腫瘤-間質(zhì)的相互作用在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要的作用,腫瘤間質(zhì)成分的改變可以破壞正常前列腺微環(huán)境的內(nèi)穩(wěn)態(tài)并影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞的凋亡能力減弱、化療耐藥能力增強(qiáng),成為晚期腫瘤治療失敗的重要原因。深入研究前列腺癌間質(zhì)在前列腺癌發(fā)病機(jī)制及疾病轉(zhuǎn)歸的作用,將對(duì)前列腺癌的防治產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的研究生物體蛋白質(zhì)的一門新興學(xué)科,是繼基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后的又一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)高通量研究方法。能大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的特征,包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、不同蛋白質(zhì)間的相互作用等。由于蛋白質(zhì)是基因功能的直接執(zhí)行者,蛋白質(zhì)組學(xué)研究可揭示生物體蛋白質(zhì)改變與機(jī)體疾病發(fā)生的關(guān)系,為闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供直接的依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)因其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn),已成為研究腫瘤標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一,在腫瘤的臨床診斷和治療方面有十分誘人的前景。本研究通過激光捕獲顯微切割結(jié)合蛋白組學(xué)技術(shù)檢測(cè)前列腺癌與癌旁良性組織的差異表達(dá)蛋白,并利用生物信息學(xué)工具對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析,篩選其中在前列腺癌間質(zhì)表達(dá)的基因。選取差異表達(dá)最明顯的間質(zhì)表達(dá)基因MYL9,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證其在前列腺癌及非癌組織的差異表達(dá),再通過大樣本組織芯片免疫組化檢測(cè)MYL9在前列腺癌的表達(dá)模式,驗(yàn)證基于蛋白組學(xué)結(jié)果篩選前列腺癌間質(zhì)標(biāo)記物的可靠性。結(jié)合前列腺組織芯片樣本相關(guān)臨床病理數(shù)據(jù)和Taylor數(shù)據(jù)庫,統(tǒng)計(jì)分析前列腺癌間質(zhì)MYL9表達(dá)與前列腺癌臨床病理分期、血清PSA水平、無生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率等臨床病理特征的關(guān)系,研究前列腺癌間質(zhì)MYL9表達(dá)在前列腺癌進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中的作用。本研究希望能發(fā)現(xiàn)前列腺癌間質(zhì)特異性標(biāo)記物,為前列腺癌上皮-間質(zhì)相互作用機(jī)制的研究提供一定的依據(jù),并為前列腺患者的治療提供潛在的間質(zhì)靶標(biāo)。研究材料：1：用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的4例前列腺癌及配對(duì)癌旁前列腺組織來源于廣州市第一人民醫(yī)院2012年5月至2012年8月行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人,患者年齡介乎于54至70歲,均屬于T2NOMO分期。用于Western Blot檢測(cè)的20例前列腺癌及配對(duì)癌旁前列腺冰凍組織取自廣州市第一人民醫(yī)院2008至2013年行前列腺癌根治術(shù)的前列腺標(biāo)本,患者年齡介乎于56-68歲(平均61.31±5.65歲)。用于RT-qPCR的40對(duì)前列腺癌及良性癌旁石蠟組織受贈(zèng)于美國哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室組織庫,這些標(biāo)本是2012年行前列腺癌根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)(TURP)的前列腺組織,患者年齡介乎于58-83歲(平均67.10±6.95),其中高分化前列腺癌12例,中分化15例,低分化13例。2：含有99例前列腺癌和81例良性前列腺組織樣本的組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司(Cat No:HPro-Ade180PG-01)。前列腺癌患者平均年齡70.71±7.99歲,其中血清PSA≥4nmol/ml的有87例、Gleason≥8的有28例。3. Taylor數(shù)據(jù)庫包含149例原發(fā)性前列腺癌及29例良性癌旁組織樣本的mRNAs水平及詳細(xì)臨床病理資料。本研究由廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所用組織樣本的處理均符合倫理及法律法規(guī)。所有標(biāo)本獲取的前列腺癌患者術(shù)前均未接受放射治療、化療或內(nèi)分泌治療。研究方法：1：收集4例新鮮前列腺癌及其配對(duì)癌旁樣本并冰凍保存,通過激光捕獲顯微切割技術(shù)獲取較純的前列腺癌和癌旁組織。提取并純化前列腺癌及癌旁組織的蛋白質(zhì),經(jīng)雙向凝膠電泳→凝膠掃描成像分析以獲得各蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù),并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)(差異表達(dá)倍數(shù)高于2)。再通過凝膠染色→差異蛋白質(zhì)點(diǎn)切割→膠內(nèi)酶解→質(zhì)譜分析明確差異表達(dá)蛋白質(zhì)的種類。2：利用人類蛋白質(zhì)圖集數(shù)據(jù)庫http://www.proteinatlas.org (HPA)、 http://www.pantherdb.org數(shù)據(jù)庫及http://www.string-db.org數(shù)據(jù)庫,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行聚類分析及蛋白質(zhì)相互作用分析,篩選出前列腺癌間質(zhì)基因。3：選取前列腺癌差異表達(dá)最明顯的間質(zhì)基因,通過RT-qQPCR檢測(cè)其在40對(duì)前列腺癌及癌旁組織的mRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)其在20對(duì)前列腺癌及癌旁組織的蛋白質(zhì)表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在前列腺癌及癌旁組織的差異表達(dá)情況。4：對(duì)大樣本前列腺組織芯片進(jìn)行免疫組化染色評(píng)分,檢測(cè)所選取的間質(zhì)基因在前列腺癌的表達(dá)模式,并分析其表達(dá)水平與前列腺癌PSA、Gleason評(píng)分、臨床病理分期和疾病轉(zhuǎn)移的關(guān)系。5：利用Taylor數(shù)據(jù)庫分析間質(zhì)基因表達(dá)水平與前列腺癌生化復(fù)發(fā)和總體生存率的關(guān)系,并分析該基因與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記蛋白E-cadherin、Vimentin的相關(guān)性,研究其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：全部資料均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組配對(duì)計(jì)量資料的均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),非配對(duì)計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。前列腺癌不同間質(zhì)比例組間基因免疫組化評(píng)分比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),并進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。候選間質(zhì)基因與E-cadherin等其他前列腺癌上皮間質(zhì)指標(biāo)的表達(dá)量關(guān)系用Pearson相關(guān)分析。生存分析第一終點(diǎn)事件是生化復(fù)發(fā),第二終點(diǎn)事件是患者死亡。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)研究間質(zhì)基因表達(dá)水平對(duì)前列腺癌生化復(fù)發(fā)和總體生存率的影響。用單因素及多因素COX回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析前列腺癌間質(zhì)基因表達(dá)與生化復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)比,研究間質(zhì)基因能否作為前列腺癌生化復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。統(tǒng)計(jì)結(jié)果P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1：蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)4對(duì)前列腺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織的蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況。雙向凝膠電泳及凝膠掃描成像分析,發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中差異表達(dá)倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點(diǎn)共有155個(gè),其中66個(gè)蛋白點(diǎn)明顯下調(diào),89個(gè)蛋白點(diǎn)明顯上調(diào)。通過凝膠染色,切取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析,共鑒定出66個(gè)蛋白質(zhì),其中40個(gè)呈上調(diào)表達(dá),26個(gè)呈下調(diào)表達(dá),其中MMC2上調(diào)表達(dá)最明顯(Average Ratio:4.29; P=0.023), MYL9下調(diào)表達(dá)最明顯(Average Ratio:-5.67; P=0.008)。2：通過HPA數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白組學(xué)所鑒定的66個(gè)前列腺癌差異表達(dá)蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)模式進(jìn)行檢索分析,發(fā)現(xiàn)主要在前列腺癌間質(zhì)中表達(dá)而癌細(xì)胞陰性或弱陽性表達(dá)的間質(zhì)基因14個(gè),其中MYL9、LPP、CKB、GSTM2、GSTP1、 DPYSL3、ACTC1、GSTM3、PRPH呈下調(diào)表達(dá),FGB、ACY1、VCL、HSPB1、MSN呈上調(diào)表達(dá)。3：進(jìn)一步通過http://www.pantherdb.org數(shù)據(jù)庫和http://www.string-db.org數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能分析及基因關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)14個(gè)間質(zhì)基因參與細(xì)胞粘附結(jié)合、細(xì)胞免疫、細(xì)胞代謝等功能,并涉及VEGF、Wnt等信號(hào)通路的調(diào)控,間質(zhì)基因相互關(guān)聯(lián)不明顯。我們選取在前列腺癌中差異下調(diào)表達(dá)最明顯的MYL9進(jìn)一步研究其在前列腺癌表達(dá)的臨床意義。4:RT-qPCR檢測(cè)MYL9在40對(duì)前列腺癌及對(duì)應(yīng)的癌旁良性組織石蠟樣本中的mRNA差異表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)MYL9在前列腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.30±0.63,顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.91±0.70(P0.001),提示MYL9在前列腺癌中的表達(dá)明顯下調(diào),與蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)結(jié)果相符。5:Western Blot檢測(cè)MYL9在20對(duì)前列腺癌與癌旁組織中的蛋白質(zhì)差異表達(dá)。結(jié)果顯示MYL9表達(dá)量在前列腺癌組織中顯著低于癌旁組織(前列腺癌=0.23±0.08,癌旁=0.73±0.06,P0.001)。6：大樣本前列腺組織芯片免疫組化結(jié)果顯示MYL9在前列腺癌及良性前列腺組織中均主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),在正常前列腺上皮細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞呈陰性表達(dá)。MYL9在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于良性癌旁組織(IRS: PCa=3.36±1.58 vs. Benign=4.85±1.02, P0.001)。MYL9的表達(dá)水平與前列腺癌的臨床分期呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.550,P0.001)。7:Kaplan-Meier生存分析顯示MYL9表達(dá)量與前列腺癌無生化復(fù)發(fā)生存率及總體生存率表現(xiàn)為顯著相關(guān)性(P值分別為0.001和0.012),前列腺癌間質(zhì)中MYL9表達(dá)水平越高,則患者無生化復(fù)發(fā)生存率及總體生存率越高。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型提示MYL9是一個(gè)能預(yù)測(cè)前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)(HR=0.53,95%CI: 0.30～0.74)和死亡(HR=0.06,95%CI:0.01～0.45)的獨(dú)立影響因素。8：MYL9與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)標(biāo)記性蛋白E-cadherin、Vimentin、TGF-β1和α-SMA的Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)MYL9表達(dá)與E-cadherin呈顯著相關(guān)(r=0.949,P0.001),與α-SMA、TGF-β1及Vimentin也有相關(guān)性(r=0.301, P=0.014; r=0.360, P0.001; r=0.336, P0.001)。提示前列腺癌間質(zhì)中MYL9表達(dá)可能與前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)重構(gòu)有關(guān)。結(jié)論：1、蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)前列腺癌差異表達(dá)蛋白質(zhì),結(jié)合生物信息學(xué)分析可以有效篩選前列腺癌間質(zhì)生物標(biāo)記物,為研究前列腺癌間質(zhì)成分在前列腺癌進(jìn)展中的作用機(jī)制提供線索。2、MYL9在前列腺癌間質(zhì)中的表達(dá)顯著低于良性癌旁組織,其下調(diào)表達(dá)參與前列腺癌的形成及進(jìn)展。3、前列腺癌組織MYL9表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān),根據(jù)MYL9表達(dá)水平可判斷前列腺癌的惡性程度。4、MYL9可以作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者總體生存率和無生化復(fù)發(fā)生存率的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo),并是前列腺癌治療的一個(gè)潛在間質(zhì)靶標(biāo)。5、前列腺癌間質(zhì)MYL9下調(diào)表達(dá)可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及前列腺癌間質(zhì)重構(gòu),促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

間質(zhì)成分包括成纖維細(xì)胞（加ｒｏｂｌａｓｔ）、膠原細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、挪巴逡逑免疫細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、血管、淋己管、神經(jīng)突觸、細(xì)胞外基質(zhì)和存在于逡逑細(xì)胞外基質(zhì)中的多種生長(zhǎng)因子及調(diào)節(jié)因子、基質(zhì)重構(gòu)酶等口］，（圖２）。逡逑Ｅ？一邋？邋ＵｆＴｉｍａ逡逑ｙ邐Ｂｌｏｏｄ邋ＶｅｓＭｔ逡逑－酒Ｖ－逡逑

本文編號(hào)：2770574