【摘要】：研究背景和目的膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿外科臨床上常見的惡性腫瘤之一,也是一個在全球范圍內(nèi)危害人類健康的棘手問題。雖然隨著醫(yī)療水平及腫瘤診治能力的提升,膀胱癌的治療也出現(xiàn)新思路,但是目前膀胱癌的治療仍是以外科手術(shù)切除為主,同時輔以放療、化療、免疫治療、靶向治療及介入治療等的綜合治療。在我國,膀胱癌的發(fā)病率雖遠(yuǎn)不及西方發(fā)達(dá)國家,但其發(fā)病率及死亡率在近幾十年來同樣呈上升趨勢。因此,對膀胱癌發(fā)生、進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥等相關(guān)機(jī)制的研究已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點(diǎn)和重點(diǎn),以期探尋新靶點(diǎn)為其診治提供理論依據(jù)。泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域樣蛋白2(ubiquitin-associated domain-containing protein 2,UBAC2)是一種存在于多物種的高度保守的蛋白質(zhì),其表達(dá)水平在不同類型及病理級別的膀胱癌中存在差異,但UBAC2在膀胱癌中的作用及機(jī)制仍有待明確。因此,本研究旨在探究UBAC2在人膀胱癌組織中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系,最后初步探索其在膀胱癌中作用及機(jī)制。研究對象和方法1.收集我院46例因膀胱癌而行根治性膀胱切除術(shù)后的新鮮手術(shù)標(biāo)本及患者相應(yīng)臨床病理資料,取手術(shù)切除下來的膀胱癌組織及其對應(yīng)正常膀胱黏膜組織,采用實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測并分析組織標(biāo)本中UBAC2基因mRNA的表達(dá)水平,同時分析UBAC2表達(dá)水平和膀胱癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。2.同時采用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry,IHC)檢測UBAC2蛋白在膀胱癌組織及其對應(yīng)癌旁正常膀胱組織中的表達(dá)水平,并分析其差異。3.采用qRT-PCR和western blot法分別檢測并分析人永生化膀胱尿路上皮細(xì)胞系SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞系EJ及UMUC3中UBAC2基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。4.根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站The Human Protein Atlas利用癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中膀胱癌患者相關(guān)臨床隨訪數(shù)據(jù)及UBAC2表達(dá)水平制作Kaplan-Meier生存曲線,分析膀胱癌患者腫瘤組織中UBAC2表達(dá)水平和患者預(yù)后之間的關(guān)系。5.構(gòu)建短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)介導(dǎo)UBAC2沉默的質(zhì)粒載體,并轉(zhuǎn)染入EJ和UMUC3細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后,更換新鮮完全培養(yǎng)基,加入嘌呤霉素,逐漸加量進(jìn)行細(xì)胞篩選。6.結(jié)合熒光倒置顯微鏡觀察篩選細(xì)胞熒光情況,分別提取沉默對照組(shNC)和UBAC2沉默組(shUBAC2)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞總RNA和蛋白,利用qRTPCR及western blot法檢測UBAC2 mRNA及蛋白沉默效率。7.利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,應(yīng)用CCK-8試劑盒及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測UBAC2沉默組及對照組細(xì)胞增殖能力的變化。8.采用qRT-PCR及western blot檢測UBAC2沉默組(shUBAC2)及對照組(shNC)細(xì)胞中與增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,明確UBAC2與p27間的可能調(diào)控關(guān)系。結(jié)果1.與正常膀胱組織(1.220±0.797)相比,UBAC2基因mRNA在膀胱癌組織(3.802±2.931)中表達(dá)明顯上調(diào)(P0.001)。免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于其對應(yīng)癌旁正常膀胱組織,UBAC2蛋白在大部分(31/46)膀胱癌組織中表達(dá)升高。對于膀胱癌細(xì)胞系,qRT-PCR結(jié)果顯示:與SV-HUC-1(1.000±0.029)細(xì)胞相比,膀胱癌細(xì)胞系EJ(2.273±0.040)和UMUC3(3.037±0.115)中UBAC2 mRNA水平均明顯上調(diào)(P0.001)。Western blot結(jié)果也顯示:EJ細(xì)胞和UMUC3細(xì)胞中UBAC2蛋白相對于SV-HUC-1細(xì)胞表達(dá)升高(P0.001)。2.臨床病理特征分析表明,UBAC2表達(dá)水平與膀胱癌病理分級明顯相關(guān)(P=0.023),而與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤大小等均無明顯相關(guān)(P0.05)。3.生存分析發(fā)現(xiàn),膀胱癌組織中UBAC2表達(dá)的高低與膀胱癌患者的生存時間顯著相關(guān)(P=0.035)。膀胱癌中UBAC2表達(dá)水平越高,膀胱癌患者的生存時間越短;相反,UBAC2表達(dá)水平越低,患者的生存時間越長。4.轉(zhuǎn)染shRNAs并經(jīng)篩選后,qRT-PCR及western blot檢測顯示shUBAC2組細(xì)胞UBAC2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平較shNC組明顯降低(P0.05),其中以shUBAC2-1及shUBAC2-3沉默效率較高,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5.CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示:EJ和UMUC3細(xì)胞中,shUBAC2組較shNC組在相對應(yīng)時間點(diǎn)450nm波長下的吸光度明顯降低(P0.05);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示EJ和UMUC3細(xì)胞中,shUBAC2組克隆形成數(shù)明顯少于shNC組(P0.001)。6.western blot結(jié)果顯示:EJ和UMUC3細(xì)胞中,shUBAC2組細(xì)胞p27蛋白表達(dá)水平較shNC組都明顯升高(P0.05),而其他與增殖相關(guān)蛋白:p21,CyclinD1,CyclinE,CDK2,CDK4,CDK6無明顯差異(P0.05)。qRT-PCR發(fā)現(xiàn),EJ和UMUC3細(xì)胞中,shUBAC2組細(xì)胞p27 mRNA表達(dá)水平均較shNC組明顯升高(P0.05)。結(jié)論1.UBAC2在膀胱癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯上調(diào),并且可以作為一個預(yù)測膀胱癌患者的預(yù)后指標(biāo)。2.沉默UBAC2能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。3.UBAC2可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控p27。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

C2 在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯上調(diào) UBAC2 基因在膀胱癌組織中表達(dá)水平，我們同時采用了方法分別在 mRNA 和蛋白水平檢測 46 對膀胱癌及其對應(yīng)的 UBAC2 基因的表達(dá)。qRT-PCR 結(jié)果顯示：與正常膀胱組相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌組織（3.802±2.93.05）（圖 3.1.1）。免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于AC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌組織中表達(dá)升高（以圖

±0.797）相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌組織（3.802±2.931）中明顯上調(diào)（P<0.05）（圖 3.1.1）。免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于正常膀胱組織，UBAC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌組織中表達(dá)升高（以圖 3.1.2 為典型）。圖 3.1.1 qRT-PCR 檢測 UBAC2 基因 mRNA 在 46 對膀胱癌及其對應(yīng)正常癌旁組織中癌組織表達(dá)水平上調(diào)

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本文編號：2724282