【摘要】：[研究目的]既往研究表明在梗阻性腎病(UUO)中,miR-433是TGF-β/smad3誘導腎纖維化的重要調節(jié)者。miR-433啟動子通過與smad3結合來放大TGF-β/smad3信號通路誘導的腎纖維化效應,同時發(fā)現(xiàn)下調miR-433的表達可顯著減輕UUO腎纖維化。腎纖維化是糖尿病腎病的病理學特點之一,基于既往研究結果,本研究通過體外細胞實驗研究證實rno-miR-433-3p在高糖刺激條件下對腎纖維化是否有影響。[對象和方法]一、qRT-PCR方法檢測rno-miR-433-3p在不同濃度高糖和高糖不同時間刺激條件下的大鼠腎小管上皮細胞(Tubular epithelial cells,TECs)表達變化規(guī)律,尋找最佳高糖刺激時間和刺激濃度;qRT-PCR方法檢測高糖刺激下TECs和腎小球系膜細胞(Glomerular mesangial cells,MMCs)中的腎臟纖維化指標(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA)表達變化規(guī)律。二、通過體外實驗分別轉染rno-miR-433-3p過表達和rno-miR-433-3p小發(fā)卡RNA rno-miR-433-3psmall hairpin RNA,rno-miR-433-3pshRNA)質粒至大鼠 MMCs和TECs中,qRT-PCR方法檢測高糖刺激下MMCs和TECs中rno-miR-433-3p表達水平和腎臟纖維化指標(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA);Western blot方法檢測高糖刺激下MMCs和TECs中腎臟纖維化指標(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SM A)表達情況。[研究結果]一、qRT-PCR檢測結果顯示,miR-433在高糖刺激的大鼠TECs中表達顯著升高(p0.01)。高糖刺激TEC表達rbno-miR-433-3p,以濃度25mM和時間48小時為明顯。高糖刺激的大鼠MMCs和TECs中Col-1,Col-4,FN,α-SMA表達顯著升高(p0.01)。二、qRT-PCR檢測結果顯示,mo-miR-433-3p在體外轉染mo-miR-433-3p過表達質粒的大鼠MMCs和TECs中表達顯著增加(p0.01);mo-miR-433-3p在體外轉染rno-miR-433-3pshRNA質粒的MMCs和TECs中表達顯著降低(P0.01)。Col-1,Col-4,FN,α-SMA在轉染rno-miR-433-3p過表達質粒的大鼠MMCs和TECs中表達顯著增加(P0.01);而其在轉染rno-miR-433-3pshRNA質粒的MMCs和TECs中表達顯著降低(p0.01)。三、Western Blot 檢測結果顯示,Co1,Col-1,FN,α-SMA 在轉染 mo-miR-433-3p過表達質粒的大鼠MMCs和TECs中表達顯著增加,而其在轉染rno-miR-433-3pshRNA質粒的MMCs和TECs中表達顯著降低。[結論]一、大鼠MMCs和TECs在不同時間和不同劑量高糖刺激下mo-miR-433-3p表達和腎纖維化指標(Col-1,Col-4,fibronectin,α-SMA)均明顯升高,并表現(xiàn)出劑量和濃度依賴。高糖可能通過誘導MMCs和TECs中rno-miR-433-3p表達參與了高糖刺激誘發(fā)腎纖維化的發(fā)病機制。二、mo-miR-433-3p 過表達質粒和 rno-miR-433-3pshRNA 質粒對于大鼠 MMCs和TECs具有較高的轉染效率,能夠過表達或抑制細胞表達rno-miR-433-3p。rno-miR-433-3p是高糖刺激誘發(fā)腎纖維化的重要調節(jié)因子。上調rno-miR-433-3p的表達可增強高糖誘導的腎纖維化,下調rno-miR-433-3p的表達可抑制高糖誘導的腎纖維化。
【圖文】：

ｒｏｕｃｔｒｏｍｒｅａｃｔｏｎ．ｕＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ邋ＰＣＲ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋ＩＩ邐１０邋ｕｌ逡逑ｄｄＨ２０邐７．６７ｕｌ逡逑總體積邐２０邋ｕｌ（３）充分混勻上述反應液，添加至ＰＣＲ管中，短暫離心以混勻試劑。逡逑（４）邐ＰＣＲ反應循環(huán)條件：９５°Ｃ邋１５ｓ，然后６０°Ｃ邋ｌｍｉｎ，６０°Ｃ邋ｌｍｉｎ，擴增共４循環(huán)。逡逑（５）循環(huán)結束后進行擴增曲線分析，實驗重復３次。逡逑采用２＿ＡＡｃｔ相對定量法計算數(shù)據(jù)：求出每個樣本的Ｃｔ值，以Ｕ６ｓｎＲＮＡ為對照，計算目的基因ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ的相對表達量。逡逑ＡＣｔ＝Ｃｔｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ－Ｃｔ邋內參逡逑△邋ＡＣｔ＝ＡＣｔ高糖組－ＡＣｔ對照組逡逑２－ＡＡｃｔ＝高糖組較對照組的相對表達倍數(shù)逡逑Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１０逡逑

昆明醫(yī)科大學碩士研宄生學位論文邋Ｂｌｏｔ邋法檢測邋ＮＲＫ５２Ｅ邋細胞中邋ｒｎｏ－ｍｉＲＮＡ－４３３－３ｐ邋過Ａ－４３３－３ｐ低表達的纖維化指標表達變化逡逑ｍＢｌｏｔ法檢測結果所示：高糖刺激下，在經(jīng)上調ｍｏ－ｍｉＲ－４３３Ｅ中，纖維化指標Ｃｏｌ－Ｉ、ＦＮ、ａ－ＳＭＡ蛋白表達水平顯著升ｉＲ－４３３－３ｐ表達的ＮＲＫ５２Ｅ中，纖維化指標Ｃｏｌ－Ｉ、ＦＮ、ｃｔ－Ｓ著降低（見圖７）。逡逑果提示：體外上調ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ或下調ｍｏ－ｍｉＲ－４３３－３ｐ，刺激腎小管上皮細胞纖維化。逡逑＿
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻】

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本文編號：2695424