【摘要】：腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC),簡稱腎癌,是泌尿系統(tǒng)位列第二的腫瘤,在成人惡性腫瘤中所占比例約為3%,其中最常見的病理類型為透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC),約占全部腎細胞癌的75%。30%的腎細胞癌患者在初診時已進入進展期和發(fā)生轉(zhuǎn)移。進展期或轉(zhuǎn)移的患者五年生存率很差,可能是發(fā)生了轉(zhuǎn)移和耐藥。因此,探討腎臟透明細胞癌發(fā)病機理并尋找有效的治療方法至關(guān)重要。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5)是最新發(fā)現(xiàn)的NLRs(NOD like receptors)家族成員,NLRC5可通過NF-κB、I型干擾素(IFN-I)及MHC-I基因的表達來參加機體的炎癥和免疫的調(diào)節(jié),尤其是與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。本課題組之前發(fā)現(xiàn)NLRC5在肝癌的組織及細胞中高表達,通過正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)肝細胞癌的細胞增殖,侵襲和遷移。而其在透明細胞腎細胞癌中的研究至今未見報道。本研究中,來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫顯示,NLRC5在透明細胞腎細胞癌組織中表達高于正常組織,并且NLRC5的表達量與患者生存預后和臨床分級密切相關(guān)。隨后,本實驗進一步探討了NLRC5對透明細胞腎細胞癌細胞系的增殖、侵襲和遷移能力的影響,并初步探討其可能作用機制。方法1.首先從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取透明細胞腎細胞癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)分析,分析癌組織和癌旁組織中NLRC5基因(mRNA)差異,并進一步探討了NLRC5基因表達與患者臨床分級和預后的相關(guān)性。2.從收集人腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎臟組織,RT-PCR,Western blotting和免疫組織化學染色法檢測人腎透明細胞癌組織中NLRC5的表達變化。同時利用Western blotting和RT-PCR檢測人類正常腎小管上皮細胞HK-2和三種腎癌細胞株Caki-1、786-O和769-P中NLRC5的表達水平。3.采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM 2000將過表達的pEGFP-C3-NLRC5重組質(zhì)粒和沉默NLRC5的小干擾RNA轉(zhuǎn)入786-O和769-P細胞系中,RT-PCR和Western blotting檢測NLRC5的mRNA和蛋白表達水平。4.采用CCK-8、流式細胞術(shù)、Transwell遷移侵襲實驗及相關(guān)蛋白表達進行體外細胞功能分析,同時觀察NLRC5表達變化對腎透明細胞癌細胞系中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響。5.將細胞分為兩組NC細胞(786-O)和穩(wěn)定低表達NLRC5細胞(786-O),將5×10~6/200μl細胞注射于裸鼠右前肢腋下,每周測量腫瘤體積,第八周處死裸鼠,剝?nèi)∧[瘤,稱量腫瘤重量,并檢測兩組腫瘤相關(guān)蛋白。結(jié)果1.TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明,與正常組織相比,癌組織中NLRC5的mRNA水平顯著升高,高表達NLRC5患者較低表達患者預后生存差,并且等級為T3-T4的患者NLRC5表達水平明顯高于T1-T2的患者。2.腎透明細胞癌組織的NLRC5蛋白和mRNA表達明顯高于癌旁組織,腫瘤細胞系中NLRC5蛋白和mRNA水平也高于正常的腎小管上皮細胞HK-2。3.Western blotting和RT-PCR實驗結(jié)果表明瞬時低表達或高表達NLRC5的細胞系轉(zhuǎn)染成功。4.過表達NLRC5能明顯加強786-O和769-P細胞增殖、侵襲和與移能力,同時Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、c-Myc和cyclinD 1蛋白水平表達量顯著升高。沉默NLRCS可明顯抑制786-O和769-P細胞系增殖、遷移與侵襲能力,同時也負向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。5.低表達NLRC5組腫瘤的生長較NC對照組慢,第八周剝?nèi)〉哪[瘤重量也較NC組輕,Western blotting結(jié)果表明低表達NLRC5組腫瘤中MMP2,MMP9,PCNA,β-catenin,c-Myc和cyclinD1蛋白比對照組NC低。結(jié)論NLRC5通過靶向Wnt/β-catenin信號通路促進透明細胞腎細胞癌增殖、遷移和侵襲功能。
【圖文】：

圖1：（A）TCGA數(shù)據(jù)庫中，NLRC5在腎透明細胞癌腫瘤組織與癌旁正常腎臟組織中NLR表達情況；（B）NLRC5基因表達量與透明細胞腎細胞癌患者生存之間的關(guān)系（以均數(shù)為標將表達量分為高低兩組）；（C）NLRC5表達量與腎透明細胞癌患者臨床分級關(guān)系。Fig. 1 (A) Box and whisker plots for NLRC5 gene expression in ccRCC tissues comparednormal kidney tissues from TCGA. (B) Kaplan-Meier survival plot represents overall survivaccRCC patients in TCGA for ccRCC patients categorized according to NLRC5 gene express(high vs low in comparison to the mean expression). (C) T stages analysis based on TCGA databshowed that ccRCC tissues stained with higher level of NLRC5 were associated with higher stprognosis. The T3-T4 vs. the T1-T2. *P< 0.05, **P<0.01, *** P<0.001.4.2 NLRC5在透明細胞腎細胞癌組織中以及透明細胞腎細胞癌細胞系中表達升高收集臨床樣本，，Western blotting和RT-PCR結(jié)果均表明癌組織中NLRC5表達

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文疫組化染色實驗（圖 3A），HE染色中，癌旁組織腎臟結(jié)構(gòu)較正常，癌組織中腎臟結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生病變，免疫組化結(jié)果中，癌旁組織幾乎不表達NLRC5，而癌組織中有明顯褐色，證明NLRC5高表達。HK-2細胞為正常腎小管上皮細胞，Caki-1，786-O,和769-P為透明細胞腎細胞癌細胞系，癌細胞系中NLRC5蛋白和mRNA表達量均明顯高于正常細胞HK-2（圖 3B和C），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。以上結(jié)果表明NLRC5可能在透明細胞腎細胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.11

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