【摘要】：目的:為了探索膀胱癌特異性治療方法,本研究采用合成生物學(xué)的原理,設(shè)計(jì)、構(gòu)建合成調(diào)控元件,特異性地識(shí)別和殺傷膀胱癌細(xì)胞。方法:構(gòu)建由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白GAL4載體、由上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)驅(qū)動(dòng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system)載體并在細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染表達(dá)。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hTERT啟動(dòng)子在人成纖維細(xì)胞HFF、膀胱癌細(xì)胞5637和T24中對(duì)下游基因的激活轉(zhuǎn)錄活性及GAL4/UAS二元表達(dá)系統(tǒng)在各細(xì)胞系中的調(diào)控作用;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)HRAS基因在對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)量變化;采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HRAS基因靶序列是否被剪切;采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn),檢測(cè)合成調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結(jié)果:雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hTERT啟動(dòng)子在膀胱癌細(xì)胞T24和5637細(xì)胞中對(duì)下游基因有轉(zhuǎn)錄激活能力,而在人成纖維細(xì)胞HFF細(xì)胞中對(duì)下游基因無(wú)轉(zhuǎn)錄激活能力;在T24和5637細(xì)胞中,融合蛋白GAL4-P65對(duì)上游激活序列UAS的激活效果顯著性地高于GAL4-VP64。qPCR結(jié)果顯示,靶向HRAS基因的調(diào)控元件顯著性地降低了HRAS在T24和5637中的表達(dá)。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示,在T24和5637細(xì)胞中,調(diào)控元件對(duì)HRAS基因進(jìn)行了基因剪切。CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人工合成調(diào)控元件對(duì)HFF細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲無(wú)明顯影響,但明顯地抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。結(jié)論:由增強(qiáng)型hTERT啟動(dòng)子、GAL4/UAS系統(tǒng)和CRISPR-Cas9工具組成的調(diào)控系統(tǒng)可以特異性地剪切膀胱癌細(xì)胞T24和5637中的HRAS基因,抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響。
【圖文】：

圖 3.1 在 HFF、T24 及 5637 細(xì)胞中不同種類質(zhì)粒的熒光表達(dá)水平。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) 細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。在這三個(gè)細(xì)胞系中，CMV-GAL4-P65 組激活熒光的能力要高于 CMV-GAL4-VP64 組。然而，在 T24細(xì)胞系和 5637 細(xì)胞系中，hTERT-GAL4-p65 組熒光表達(dá)要明顯強(qiáng)于對(duì)照組，，在 HFF細(xì)胞系中沒(méi)有差別。數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)被重復(fù)三次，每次設(shè)有三個(gè)重復(fù)組。每個(gè)誤差條表示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值之間的變化。Fig. 3.1 Luciferase expression levels of several different kinds of vectors in HFF, T24and 5637 cells. The luciferase activities in HFF (A), T24 (B) and 5637 (C) cells weremeasured by the dual luciferase reporter assay. The luciferase activities in theCMV-GAL4-P65 group were significantly higher than those in the CMV-GAL4-VP64group in these three cell lines. However, while the activities in the hTERT-GAL4-p65

采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系 T24 和 5637 及人成纖維細(xì)胞 HFF 的 HRAS 表達(dá)量，如圖所示，與人成纖維細(xì)胞系 HFF 相比，轉(zhuǎn)染人工合成載體后，HRAS 基因在 T24 和 5637 細(xì)胞中都有明顯的下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在 HFF 細(xì)胞系中，則無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2688733