【摘要】：腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是較常見的癌癥,也是最致命的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。然而,它不是一個單一的實體,而是多種腫瘤的集合,被認(rèn)為是腎小管幾個部分表型的再現(xiàn),每個部分都有不同的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征。腎腫瘤與許多其他侵襲性或浸潤性腫瘤不同,呈舌狀微細(xì)延伸至腎靜脈或腎竇,通常無纖維增生性或破壞性浸潤反應(yīng)。因此,與其他器官的癌癥相比,腎細(xì)胞癌較不易被發(fā)現(xiàn)。深入了解腎臟解剖,對組織進(jìn)行充分取樣,并在大體檢查和顯微鏡分析中對這些重要發(fā)現(xiàn)進(jìn)行預(yù)測和仔細(xì)研究是較為重要的。NPM1屬于組蛋白伴侶家族,核仁蛋白/核質(zhì)蛋白(NPM)家族,包括多個主要功能成員(NPM1,NPM2,NPM3和無脊椎動物NPM),并且可以在所有多細(xì)胞動物中找到。雖然這個家族在功能上有很好的特征,但人們對這些基因和蛋白質(zhì)的進(jìn)化知之甚少。本研究旨在應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法研究腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織與癌旁組織之間蛋白表達(dá)譜的差異,從而建立腎透明細(xì)胞癌的差異表達(dá)譜,目標(biāo)是通過對部分蛋白的研究,進(jìn)一步了解腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因子或抑制因子。我們從差異表達(dá)蛋白譜中選取NPM1作為目標(biāo)蛋白,采用免疫印跡(Western Blot)的方法驗證了其表達(dá)情況;免疫組化分析不同分化程度的腎透明細(xì)胞癌中蛋白NPM1的表達(dá)情況;構(gòu)建NPM1過表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,觀察RNA干擾NPM1基因的表達(dá)對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O的增殖、侵襲及遷移的影響作用,從而進(jìn)一步了解NPM1對腎透明細(xì)胞癌的影響。本研究共分為四部分第一部分:腎透明細(xì)胞癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜的建立方法:1、選取10例腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織標(biāo)本及配對的癌旁正常組織標(biāo)本作為研究對象。所用癌旁組織均取自癌組織上端,且距離癌組織均大于5厘米。所有患者術(shù)前均未接受任何化療和放療,且腫瘤組織標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)證實為腎透明細(xì)胞癌。術(shù)中切除的組織經(jīng)PBS沖洗放入液氮速凍,再置于-80℃冰箱保存。2、提取腫瘤組織和癌旁組織中的總蛋白,并分析組織的蛋白質(zhì)濃度。3、制備蛋白水解多肽混合物。4、采用二維液相色譜法進(jìn)行樣本的分離。5、通過LTQ XL離子阱質(zhì)譜儀對二維色譜洗脫的多肽進(jìn)行檢測。6、對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找到癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果:1、經(jīng)二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析,在腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本中共獲得了846個蛋白質(zhì)點(diǎn);癌旁組織中共獲得了535個蛋白質(zhì)點(diǎn)。將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行比對,并經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共有35個。2、在腫瘤組織中上調(diào)表達(dá)的20個蛋白質(zhì)分別是:NPM1、AHNAK2、PDIA3、MCT4、Cyp A、SKP1、CA9、SCGN、KRT18、HAPLN2、TGM2、CPQ、ACY1、POSTN、PAH、FREM2、LAMA4、CSPG4、GBP1、RBP4。3、在腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)的15個蛋白質(zhì)分別是:C11ORF54、APOA4、SERPINA5、AGXT2、CHDH、NNT、ACE、ISCU、PRDX3、AK2、PNP、NPL、MRPL44、PHYH、GRHPR。4、通過本次研究我們建立了腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)蛋白譜,為進(jìn)一步深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供實驗數(shù)據(jù)。5、從差異表達(dá)蛋白譜中選取NPM1作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。第二部分:NPM1差異表達(dá)的驗證及其與相關(guān)臨床病理資料信息的關(guān)系分析方法:1.選取10例原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本和10例配對癌旁組織標(biāo)本,用Western-blot的方法鑒定目標(biāo)蛋白NPM1在腎透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。2.收集100例不同分期的腎透明細(xì)胞癌患者的病切片,免疫組化法觀察蛋白NPM1的表達(dá)與患者分期的相關(guān)性。結(jié)果:1.在隨機(jī)選取的10組腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本中,對比分析目標(biāo)蛋白NPM1分別在腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)蛋白NPM1在腎透明細(xì)胞癌組織中上調(diào)表達(dá)。2.通過統(tǒng)計學(xué)分析,認(rèn)為NPM1蛋白的表達(dá)可以提示與腫瘤的TNM分期(p0.05)相關(guān);然而NPM1蛋白的表達(dá)水平與患者性別、年齡無相關(guān)性(p0.05)。第三部分:NPM1在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其過表達(dá)對細(xì)胞生物功能的影響方法:1、制備NPM1過表達(dá)及低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株。2、在熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O、NPM1-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O內(nèi)NPM1蛋白的表達(dá)情況。3、Western-blot及RT-PCR驗證各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中NPM1的基因水平及蛋白水平。4、觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O、NPM1-sh RNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O增殖侵襲、遷移的影響。結(jié)果:1、我們成功構(gòu)建了NPM1過表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。2、我們通過觀察腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O中,NPM1不同表達(dá)水平情況下細(xì)胞的生長能力,觀察NPM1對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。觀察細(xì)胞生長曲線,結(jié)果顯示:與control組相比,NPM1過表達(dá)時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O生長能力明顯增強(qiáng)(p0.05),而NPM1表達(dá)降低時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O生長能力明顯減弱(p0.05)。3、我們通過觀察腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O中,NPM1不同表達(dá)水平情況下細(xì)胞的遷移能力,觀察NPM1對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞遷移的結(jié)果顯示:NPM1過表達(dá)時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O遷移能力明顯增強(qiáng)(p0.05),而NPM1表達(dá)降低時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O遷移能力明顯減弱(p0.05)4、我們通過觀察腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O中,NPM1不同表達(dá)水平情況下細(xì)胞的侵襲能力,觀察NPM1對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。NPM1過表達(dá)時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O侵襲能力明顯增強(qiáng)(p0.05),而NPM1表達(dá)降低時,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O侵襲能力明顯減弱(p0.05)。第四部分:穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在裸鼠中的成瘤情況方法:選取4周齡的SPF級裸鼠,將成功篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株經(jīng)皮下注入到裸鼠體內(nèi),30天后統(tǒng)一處死,取出瘤體,量取腫瘤的大小并稱重,Western-blot檢測瘤體中蛋白NPM1的表達(dá)水平,分析蛋白NPM1不同表達(dá)水平下的瘤體之間的差異性。結(jié)果:1、各組腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O接種后第9天,即可在裸鼠皮下觀察到腫瘤結(jié)節(jié),隨著時間的延長瘤體逐漸增大,觸之較硬,與周圍邊界清晰。2、稱重瘤體,結(jié)果顯示NPM1-overexpressed組裸鼠瘤體平均重量明顯高于control組(p0.05);NPM1-sh RNA組裸鼠瘤體平均重量明顯低于相應(yīng)的control組(p0.05)。3.我們應(yīng)用Western-blot檢測了裸鼠移植瘤組織內(nèi)NPM1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示NPM1-overexpressed組中NPM1蛋白表達(dá)高于control組(p0.05);NPM1-sh RNA組NPM1蛋白表達(dá)明顯低于NC組(p0.05)。通過以上研究,我們得出以下結(jié)論:1.二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析差異蛋白的結(jié)果,可用于對腫瘤中的差異蛋白的檢測。2.腎透明細(xì)胞癌組織中NPM1的表達(dá)量顯著高于癌旁組織;發(fā)現(xiàn)蛋白NPM1的表達(dá)與TNM分期相關(guān)。3.蛋白NPM1的表達(dá)對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移均有促進(jìn)作用。4.通過體內(nèi)裸鼠成瘤實驗,驗證了體外實驗中觀察到的蛋白NPM1對腫瘤的增殖的促進(jìn)作用。
【圖文】：

核仁磷酸蛋白（Recombinant Nucleophosmin, NPM1），也稱為B23，No38或Numatrin，是在增殖性較強(qiáng)細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的豐富的核仁蛋白。NPM1已被證明參與核糖體生物起源、mRNA加工、染色質(zhì)重塑和胚胎形成（圖1.1）。雖然人們對NPM1在代謝途徑中的功能了解很多，但很明顯NPM1還通過在各種DNA修復(fù)途徑中起作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而具有維持基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵功能。在本綜述中，我們闡述了上述功能的最新概述，特別是NPM1在DNA修復(fù)中的作用的最新數(shù)據(jù)，NPM1功能障礙如何導(dǎo)致癌癥病變。圖1.1 細(xì)胞內(nèi)NPM1功能概述NPM1通過與組蛋白和其他染色質(zhì)重塑蛋白結(jié)合，參與人類生物過程，，如DNA修復(fù)，胚胎形成，可能通過與染色質(zhì)相互作用。 重要的是，NPM1還促進(jìn)核糖體的形成

由12個外顯子組成，編碼至少兩個亞型(圖1.2a)[1]。NPM1.1(或B23.1)與全長轉(zhuǎn)錄物對應(yīng)，故而在所有組織中有294個氨基酸蛋白(35-40kda)的大量表達(dá)。另外,NPM1.3(也稱為B23.2)擁有不同的3′外顯子，并編碼在細(xì)胞中以低水平表達(dá)的蛋白質(zhì)，缺少NPM1 C末端的最后35個氨基酸[2]。NPM1.2的第三種亞型已經(jīng)被提出，但是到目前為止，沒有生物學(xué)數(shù)據(jù)支持這一發(fā)現(xiàn)[3]。NPM1屬于組蛋白伴侶家族，核仁蛋白/核質(zhì)蛋白（NPM）家族，包括多個主要功能成員（NPM1，NPM2，NPM3）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.11

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本文編號：2662147