【摘要】：[研究目的]本研究以體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞(Human Kidney-2 cells,HK-2 cells)為研究對象。首先,明確高糖下HK-2中的MALAT1表達升高,其后,探討MALAT1介導高糖作用下的HK-2細胞發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)與損傷。最后,探討MALAT1介導細胞EMT與損傷的通路機制。[研究方法]1.檢測高糖刺激下HK-2細胞中MALAT1的表達:將細胞分為正常組、甘露醇組、高糖組,分別刺激12、24、36以及48小時,RT-qPCR法檢測MALAT1的mRNA水平;2.MALAT1介導高糖刺激下HK-2細胞發(fā)生的EMT與損傷:轉(zhuǎn)染siRNA-MALAT1及negative control siRNA,用免疫印跡法檢測EMT標志蛋白E-cadherin、α-SMA 的蛋白水平,用 RT-qPCR 法檢測 E-cadherin、α-SMA 以及腎小管損傷標記因子KIM-1、NGAL的mRNA水平,用ELISA法檢測KIM-1、NGAL的蛋白水平;3.MALAT1在HK-2EMT和損傷中的作用機制:轉(zhuǎn)染siRNA后,用免疫印跡法檢測β-catenin、c-Myc、cyclin D1的蛋白水平,用細胞免疫熒光方法觀察β-catenin的細胞定位;隨后,分組分為正常組、甘露醇組、高糖組、LiC1組、HG+DKK-1/DKK-1組,檢測細胞EMT、損傷及Wnt/β-catenin標志物的表達;最后,將組別分為高糖+siRNA-MALAT1組、高糖+siRNA-MALAT1+LiC1組、高糖+siRNA-MALAT1+DKK-1組,檢測EMT標志物的mRNA、蛋白水平及Wnt/β-catenin標志物的蛋白水平。[結(jié)果]1.高糖誘發(fā)HK-2細胞中的MALAT1表達增加RT-qPCR結(jié)果顯示:高糖組中MALAT1的表達隨時間增加逐漸升高,其中36小時達到高峰,而甘露醇對HK-2的MALAT1的表達幾乎無影響。2.MALAT1介導高糖誘發(fā)的HK-2細胞的EMT和損傷免疫印跡結(jié)果和RT-qPCR結(jié)果顯示:高糖誘導HK-2的E-cadherin下降,α-SMA升高,在轉(zhuǎn)染siRNA-MALAT1后,該現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn),而轉(zhuǎn)染了 negative control siRNA序列的組,兩者的表達與高糖組無明顯差異;RT-qPCR和ELISA顯示:高糖能上調(diào)KIM-1和NGAL的蛋白和mRNA水平,甘露醇對該兩者無影響。轉(zhuǎn)染siRNA-MALAT1后,該現(xiàn)象被部分逆轉(zhuǎn),而轉(zhuǎn)染了negative control siRNA序列的組,兩者的表達水平與高糖組無統(tǒng)計學差異。3.MALAT1介導HK-2細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活免疫印跡結(jié)果顯示,高糖與LiC1能上調(diào)CyclinD1,c-Myc,和β-catenin的蛋白水平,而DKK-1能部分逆轉(zhuǎn)高糖的這些影響,甘露醇組對HK-2細胞無此影響;最后轉(zhuǎn)染siRNA-MALAT1后,CyclinD1,c-Myc,和β-catenin的蛋白水平下調(diào),而轉(zhuǎn)染了negative control siRNA序列和高糖組之間這些蛋白的表達無統(tǒng)計學差異。4.MALAT1通過激活Wnt/β-catenin信號通路介導HK-2細胞的EMT敲除MALAT1后加入LiC1,部分升高的E-Cadherin與部分降低的α-SMA又重新被誘發(fā)降低與升高,而加入DKK-1后,部分升高的E-Cadherin與部分降低的α-SMA得到進一步的緩解。5.MALAT1可能不通過激活Wnt/β-catenin信號通路介導HK-2細胞的損傷加入LiC1之后,RT-qPCR和ELISA的結(jié)果顯示,KIM-1與NGAL的表達相對于正常組有明顯的下調(diào)趨勢,而加入DKK-1之后,其表達與高糖組無明顯差異。提示MALAT1升高能誘發(fā)腎小管上皮細胞的損傷,而激活Wnt/β-catenin信號通路可能對HK-2的損傷因子有著保護的作用。[結(jié)論]高糖通過上調(diào)MALAT1的表達誘導HK-2細胞發(fā)生EMT與損傷,其中發(fā)生EMT機制可能與MALAT1異常激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān),但是MALAT1可能并不直接通過激活Wnt/β-catenin信號通路介導HK-2細胞的損傷。
【圖文】：

１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ。結(jié)果顯示，與正常組相比，隨著高糖作用時間的延長，ＨＫ－２逡逑細胞中的ＭＡＬＡＴ１的ｍＲＮＡ表達水平也逐漸升高，其中３６ｈ時達到峰值，而逡逑與之滲透壓相等的甘露醇組的ＭＡＬＡＴ１無明顯變化（圖１，Ｐ＜０．０５；統(tǒng)計結(jié)果：逡逑表１），，說明這些變化與滲透壓無關(guān)。逡逑□邋１２ｈ逡逑0邋３－１邋□邋２４邋ｈ逡逑Ｉ邐灥邋３６ｈ邐＊逡逑Ｚ邋？邋Ｈ邋４８ｈ邐＿邐＊逡逑ＩＩ邐２－邐ｉ逡逑Ｔ邋ｔ邐Ｉ逡逑１－邋ｎｎｌｌ邋ｎＲ邋ｆｌｓ邋］邋ｉｌｌ逡逑ｒｊｉｉ邋ａａｕ逡逑一邋ｗｉｉｉｉｌｌｉ邋１１邐１１１逡逑圖１高糖使ＨＫ－２細胞的ＭＡＬＡＴ１表達增高（ＲＴ－ｑＰＣＲ）逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｈｉｇｈ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ＭＡＬＡＴ１邋ｉｎ邋ＨＫ－２邋ｃｅｌｌｓ逡逑將人ＨＫ－２細胞作用于正常培養(yǎng)基組（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）、甘露醇組（５．５ｍｍｏｌ／Ｌ葡逡逑萄糖＋２４．５ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇）與高糖組（３０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖），分別共同孵育１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、逡逑４８邋ｈ。在相應時間點收集細胞，提取ＲＮＡ，進行熒光定量ＰＣＲ，檢測ＭＡＬＡＴ１的ｍＲＮＡ逡逑的表達水平。結(jié)果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示

別是邋ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－３０９７邋與邋ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－６１０８邋序列，轉(zhuǎn)染效率分別是邋７１％、逡逑６６％，而ＭＡＬＡＴｌｓｉＲＮＡ－５６３９序列與正常對照組無明顯統(tǒng)計學差異，轉(zhuǎn)染效率逡逑僅為３０％（圖２，邋Ｐ＜０．０５，統(tǒng)計結(jié)果：表２）。故而本實驗選擇ＭＡＬＡＴ１邋ｓｉＲＮＡ－３０９７逡逑序列作為后續(xù)實驗的最優(yōu)序列。逡逑２４逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻】

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1 Kevin Louis;Alexandre Hertig;;How tubular epithelial cells dictate the rate of renal fibrogenesis?[J];World Journal of Nephrology;2015年03期

2 黃寶英;曹羅元;富顯果;劉金發(fā);楊菁;陳剛;;丹參酮ⅡA對高糖誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中Wnt/β-catenin信號途徑的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2012年07期

3 易著文;陳丹;;腎小管上皮細胞損傷在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用[J];實用兒科臨床雜志;2007年17期

本文編號：2633905