【摘要】：目的:探討自噬抑制劑HCQ聯(lián)合化療藥物DOC對去勢抵抗性前列腺癌22RV1細胞株體內外的增殖影響,及其自噬基因Bcelin-1、自噬特異性底物P62、促凋亡基因Bax mRNA的表達變化與自噬蛋白Bcelin-1、自噬特異性標記物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax的表達影響,以進一步了解CRPC患者對化療藥物產生抵抗的生物學機制,為臨床通過自噬水平的調節(jié)來治療CRPC提供一定的研究基礎,也為CRPC患者的耐藥監(jiān)測提供檢測靶點。方法:體外培養(yǎng)去勢抵抗性前列腺癌22RV1細胞株,體內建立去勢抵抗性前列腺癌22RV1細胞株裸鼠移植瘤動物模型,分別設置空白對照組和DOC、HCQ+DOC兩個實驗組,其中體外DOC和HCQ+DOC實驗組下分別設置DOC為10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L三個濃度組。HCQ+DOC實驗組采用自噬抑制劑HCQ進行自噬干預后再行DOC給藥。分別觀察細胞增殖活性的改變及體內移植瘤生長體積的變化,同時應用qPCR技術檢測22RV1細胞株和移植瘤中Beclin-1、P62、Bax mRNA以及Western blot技術檢測Beclin-1、LC3B、Bax蛋白質的表達水平。結果:1.體外細胞增殖變化:DOC和HCQ+DOC各實驗組與空白對照組比較,細胞的增殖程度均出現(xiàn)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);在DOC和HCQ+DOC實驗組中,細胞的增殖活性均隨著DOC濃度的增加而減弱,兩兩比較的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);在同一DOC濃度下,HCQ+DOC組細胞的增殖程度均較DOC組更低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。其中DOC濃度為10~(-7)mol/L時,差異最為顯著。DOC+HCQ聯(lián)合用藥時藥物DOC的IC50也由單獨作用時的10~(-6.120)mol/L下降為10~(-7.536)mol/L。2.體內移植瘤生長體積變化:DOC和HCQ+DOC各實驗組與空白對照組相比較,隨著周次增加,移植瘤增長體積出現(xiàn)逐漸降低的趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);在DOC和HCQ+DOC兩個實驗組間比較,HCQ+DOC組移植瘤周體積增長值均不同程度低于DOC組,到第四周HCQ+DOC組的周體積增長值較DOC組出現(xiàn)了明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.mRNA檢測結果:(1)體外培養(yǎng)細胞株mRNA檢測:與空白對照組相比較,DOC組和HCQ+DOC組基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表達量均都有所上升;與DOC組相比較,HCQ+DOC組的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表達量更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)體內移植瘤細胞mRNA檢測:與空白對照組相比較,DOC組的基因Beclin-1、Bax以及HCQ+DOC組的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表達量都有所上升;與DOC組相比較,HCQ+DOC組的基因Beclin-1、P62、Bax mRNA的表達量更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.蛋白質檢測結果:(1)體外培養(yǎng)細胞株各蛋白檢測:相對于空白對照組,實驗組DOC和HCQ+DOC的自噬蛋白Beclin-1、自噬特異性標記物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax都出現(xiàn)高表達,且HCQ+DOC組的表達更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)體內移植瘤細胞各蛋白檢測:相對于空白對照組,實驗組DOC和HCQ+DOC的自噬特異性標記物LC3B蛋白、促凋亡蛋白Bax表達均出現(xiàn)上調,且HCQ+DOC組的表達更高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);HCQ+DOC組自噬蛋白Beclin-1的表達則明顯高于空白對照組與DOC組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:本實驗結果表明在體內外使用自噬抑制劑HCQ對去勢抵抗性前列腺22RV1細胞株進行自噬干預,可明顯抑制前列腺癌細胞的增殖,同時能明顯增強Beclin-1、P62、Bax mRNA的表達及Beclin-1、LC3B、Bax蛋白的表達,從而調節(jié)自噬表達的下調過程。由此我們認為自噬抑制劑HCQ可增強前列腺癌22RV1細胞株對化療藥物DOC的敏感性。
【圖文】：

給藥結束后第三天采用頸椎脫臼法處死裸鼠，采用剪刀、鑷子等工具，迅速剝離出瘤體，分成 4-5 小塊兒，用錫箔紙包裹起來，做好標記，置于盛有干冰的盒子里面，待所有裸鼠取材完畢后，將腫瘤塊兒轉移至液氮中保存，以供后續(xù)mRNA 和蛋白質的檢測。3 統(tǒng)計分析方法采用統(tǒng)計軟件 SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 6.0 進行作圖，計量數(shù)據(jù)均用（ X ± SD)來表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇方差分析或非參數(shù)分析比較組間差異，，以 P＜0.05 表示有統(tǒng)計學意義。4 實驗結果4.1 體外細胞實驗結果4.1.1 藥物作用的細胞增殖狀態(tài)

各小組細胞被相應藥物作用 72h 后的增殖程度見圖 1：與空白對照組比較，DOC 組和 HCQ+DOC 組中細胞的增殖都有所減弱，細胞死亡增多，細胞碎片增多，狀態(tài)更差；在 DOC 和 HCQ+DOC 實驗組下，各小組細胞的增殖活躍度隨著化療藥物 DOC 濃度的增加逐漸降低，細胞死亡增多；在同一 DOC 濃度下，HCQ+DOC 組細胞的增殖能力較 DOC 組均出現(xiàn)下降，細胞死亡增多。4.1.2 CCK-8 法藥物敏感實驗結果及統(tǒng)計學處理各實驗組吸光度檢測結果見表 2，根據(jù)各組吸光度值作圖見圖 2。表 2 各實驗組細胞 CCK-8 結果（ X ± SD)空白對照 DOC6 DOC7 DOC8 HCQ+DOC6 HCQ+DOC7 H值 0.9800±0.0075 0.4797±0.0092 0.5710±0.0080 0.6048±0.0087 0.3650±0.0083 0.4410±0.0094 0.5
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 高靈素;虞國慧;;自噬對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖的影響[J];安徽醫(yī)藥;2015年04期

2 唐禮功;謝森;潘鐵軍;李志雄;陳歡歡;井瑩;;低氧通過誘導自噬增強小鼠前列腺癌細胞的化療抵抗作用[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2013年06期

相關碩士學位論文 前2條

1 姬凌;細胞自噬調節(jié)造血干細胞靜息機制的初步探討[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

2 江鳳;自噬在骨髓增生異常綜合征疾病演進過程中的作用研究[D];蘇州大學;2015年

本文編號：2631852