【摘要】：研究背景膀胱尿路上皮癌(urothelial bladder cancer,UBC)又稱(chēng)為膀胱移行細(xì)胞癌,是一種十分常見(jiàn)的惡性腫瘤,對(duì)公眾健康有著重要的影響。在全世界范圍內(nèi),UBCs的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的第七位,女性惡性腫瘤的第十七位。其中,非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)為UBCs中最常見(jiàn)的類(lèi)型,大約有75%新診斷的UBC為NMIBC。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是治療NMIBC的金標(biāo)準(zhǔn),但是高達(dá)70%的NMIBC患者經(jīng)TURBT治療后會(huì)復(fù)發(fā)。非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌已經(jīng)成為實(shí)體腫瘤中復(fù)發(fā)率最高的腫瘤。因其超高的復(fù)發(fā)率,NMIBC亦已成為治療費(fèi)用最昂貴的腫瘤之一。NMIBC的復(fù)發(fā)可能與膀胱局部非常隱蔽的微小轉(zhuǎn)移灶有關(guān),但是由于膀胱局部血供有限,常規(guī)的靜脈化療給藥只有一小部分藥物能夠最終到達(dá)膀胱腫瘤局部,效果不佳且有較大的全身副作用。因此,NMIBC患者TURBT術(shù)后應(yīng)行膀胱灌注,即化療藥物通過(guò)導(dǎo)管直接注入膀胱,以獲得較高的局部濃度和較小的全身副作用。傳統(tǒng)膀胱灌注的局限性主要是灌注的化療藥物濃度難以維持,以及在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間有限;膀胱灌注的化療藥物隨時(shí)間被尿液稀釋,并在排尿時(shí)由尿道排出。因此,提高膀胱灌注的化療藥物作用時(shí)間是一項(xiàng)改善NMIBC臨床預(yù)后和降低治療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的重要研究課題,本研究旨在開(kāi)發(fā)一種新型膀胱灌注系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)化療藥物在膀胱內(nèi)的持續(xù)起效。碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)因其超高的比表面積,較高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性,且其碳原子sP2雜化方式易通過(guò)π-π吸附作用與部分有相似結(jié)構(gòu)的化療藥物相結(jié)合,己被研究用于化療藥物的載藥和傳送。碳納米管分為單壁碳納米管(singlewalled carbon nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs)。MWCNTs的生物毒性低于SWCNTs,被強(qiáng)酸處理后的羧基化多壁碳納米管(carboxylated multiwalled carbon nanotubes,mMWCNTs,MWCNTs-COOH)不僅減輕了碳納米管的毒性,而且提高了碳納米管在水溶液中的分散性。本研究初步設(shè)計(jì)使用MWCNTs-COOH負(fù)載化療藥物用于膀胱灌注。然而,MWCNTs-COOH本身并不能延長(zhǎng)化療藥物在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間。近些年來(lái),磁性納米顆粒由于其固有的納米材料特性、具有良好的超順磁性能,以及其在癌癥診斷和治療中的巨大潛力而備受關(guān)注。本課題組之前的研究表明,包括四氧化三鐵(Ferrosoferric oxide,Fe3O4)磁性納米顆粒在內(nèi)的溫敏凝膠系統(tǒng),在外加磁場(chǎng)的作用下可以延長(zhǎng)化療藥物在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間。然而,溫敏凝膠系統(tǒng)對(duì)NMIBC患者的膀胱灌注治療作用有限:首先,溫敏凝膠體系中的大多數(shù)藥物被交聯(lián)的松散結(jié)構(gòu)分散開(kāi),使化療藥物與膀胱粘膜分離;其次,溫敏凝膠可能由于自身的膨脹作用而阻塞膀胱輸尿管口;第三,溫敏凝膠體系的溫度依賴(lài)性制備方法限制了其臨床應(yīng)用。因此,本研究引入磁性Fe304納米顆粒修飾羧基化的多壁碳納米管,創(chuàng)新性的制備了一種基于磁性羧基化多壁碳納米管(magnetic carboxylated multiwalled carbon nanotubes,mMWCNTs)的膀胱內(nèi)灌注載藥系統(tǒng),在外加磁場(chǎng)的作用下,mMWCNTs能夠顯著延長(zhǎng)其負(fù)載藥物的膀胱內(nèi)滯留時(shí)間。膀胱癌最常用的膀胱灌注化療藥物包括吡柔比星、表柔比星(epirubicin,EPI)、多柔比星、羥喜樹(shù)堿、絲裂霉素和吉西他濱等。對(duì)于NMIBBC患者,TURBT術(shù)后早期灌注EPI是一種安全有效的方法。EPI是一種蒽環(huán)類(lèi)細(xì)胞抑制劑,是多柔比星的異構(gòu)體。與多柔比星相比,EPI具有更低的心臟和血液毒性。多壁碳納米管表面可以通過(guò)π-π吸附作用有效負(fù)載EPI。并且,因?yàn)槠涑叩谋缺砻娣e和表面功能基團(tuán)的作用,mMWCNTs負(fù)載EPI的能力優(yōu)于MWCNTs。因此,本研究提出了一種基于mMWCNTs的膀胱灌注緩釋系統(tǒng):mMWCNTs負(fù)載EPI形成磁性竣基化多壁碳納米管表柔比星復(fù)合物(magnetic carboxylated multiwalled carbon nanotubes-epirubicin,mMWCNTs-EPI),成功解決了上文提到的問(wèn)題。研究目的本研究的目的是報(bào)道一種用于膀胱內(nèi)灌注的mMWCNTs-EPI藥物緩釋系統(tǒng),以取代目前的膀胱灌注方式。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)由羧基化多壁碳納米管、Fe3O4磁性納米顆粒和蒽環(huán)細(xì)胞抑制劑表柔比星組成。本研究首先構(gòu)建了mMWCNTs載藥系統(tǒng),并檢測(cè)了其形貌、磁響應(yīng)性、功能基團(tuán)及各項(xiàng)理化性質(zhì);并于體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了mMWCNTs載體的生物安全性以及其在體內(nèi)的滯留效應(yīng)。在外加磁場(chǎng)的作用下,檢測(cè)了mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)持續(xù)釋放EPI的能力。并通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)與單純應(yīng)用EPI相比,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)對(duì)膀胱癌的抑制作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法磁性多壁碳納米管(mMWCNTs)的制備本研究使用混酸將催化化學(xué)氣相沉積法制備的MWCNTs羧基化,形成MWCNTs-COOH。然后用共沉淀法將Fe3O4附著于MWCNTs-COOH表面,形成mMWCNTs。首先,750 mg MWCNTs經(jīng)80 kHz超聲振動(dòng)30 min,分散于300 mL的混酸溶液中(硫酸:硝酸=1:3)。然后將混懸液加熱到95°C維持4 h,MWCNTs在混酸的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸WCNTs-COOH。MWCNTs-COOH在鼓風(fēng)干燥箱中干燥后,將100 mg干燥的MWCNTs-COOH樣品超聲分散于雙蒸水中,并加入42.8 mg FeC1l24H20和116.8 mg FeC13·6H2O(Fe2+:Fe3+的摩爾比為1:2)。干燥的MWCNTs-COOH與預(yù)計(jì)反應(yīng)生成的Fe304的質(zhì)量比為2:1。反應(yīng)體系通氬氣0.5 h,去處體系中的氧氣。然后將反應(yīng)體系加熱到60°C,并加入適量氨水。反應(yīng)體系在60°C保持2 h,然后加熱到90°C,保持0.5 h,生成終產(chǎn)物mMWCNTs。mMWCNTs用雙蒸水清洗數(shù)遍并于鼓風(fēng)干燥箱中干燥。干燥后的mMWCNTs置于超凈工作臺(tái)中,用紫外輻射法殺菌。mMWCNTs形貌及理化性質(zhì)的表征mMWCNTs的透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)圖像由JEM-1011透射電子顯微鏡采集,加速電壓為60 kV。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy,FESEM)圖像由日立SU-70掃描電子顯微鏡系統(tǒng)在30-100 kV加速電壓下采集。干燥后的mMWCNTs固定在碳膠帶上,用離子鍍金機(jī)鍍上一層金后進(jìn)行FESEM掃描。mMWCNTs的Zeta電勢(shì)通過(guò)Delsa?納米C粒子分析儀獲得。mMWCNTs的傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)經(jīng)ALPHA傅里葉變換紅外分光計(jì)測(cè)定。波長(zhǎng)范圍為4000～400 cm-1,分辨率為4 cnr1。采用X'Pert3粉末衍射儀采集mMWCNTs的X射線衍射(X-ray-diffraction,XRD)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。采用MicroMagT?Model 2900交變梯度磁強(qiáng)計(jì)(alternating gradient force magnetometer,AGM),檢測(cè)mMWCNTs的磁響應(yīng)性。用2 mg/mL的mMWCNTs混懸液外加磁場(chǎng)觀測(cè)mMWCNTs的宏觀磁性。細(xì)胞培養(yǎng)T24細(xì)胞在添加10%胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)的McCoy'5A培養(yǎng)基中培養(yǎng);5637細(xì)胞在添加10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的細(xì)胞均在37°C,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期獲取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞活力測(cè)定采用CCK-8法檢測(cè)mMWCNTs對(duì)細(xì)胞活力的影響。5637和T24細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度種于96孔板中。細(xì)胞貼壁后,將mMWCNTs以0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/mL的終濃度分別刺激5637和T24細(xì)胞,每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,并設(shè)立空白對(duì)照組。72h后按照說(shuō)明書(shū)向96孔板中加入CCK-8溶液,孵育4h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。將結(jié)果繪制柱狀圖。采用CCK-8法檢測(cè)mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)對(duì)5637和T24細(xì)胞的殺傷作用。以上述細(xì)胞密度分別將5637和T24細(xì)胞種于96孔板中。第1組為對(duì)照組。第2～4組為實(shí)驗(yàn)組,按照下述方法加刺激:第2組,40 μg/mL的mMWCNTs混懸液并外加磁場(chǎng);第3組,終濃度為2 μg/mL的EPI溶液;第4組,mMWCNTs-EPI混懸液(EPI的終濃度為2 μg/mL)并外加磁場(chǎng)。分別在第2、4、6、8、10、12、24 h對(duì)所有組更換培養(yǎng)基以模擬正常排尿規(guī)律。按照說(shuō)明書(shū)向96孔板中加入CCK-8溶液,孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制柱狀圖。細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)定為了觀察mMWCNTs對(duì)細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白骨架排列及細(xì)胞形態(tài)的影響,本課題將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(fluorescein isothiocyanate-phalloidin,FITC-phalloidin)染色。5637和T24細(xì)胞分別分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用終濃度為40 μg/mL的mMWCNTs混懸液處理72 h。對(duì)照組以等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)處理72 h。處理結(jié)束后用冷甲醇固定細(xì)胞10 min,FITC-phalloidin染色1h,并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡拍照。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mMWCNTs的生物安全性用12只雌性Wistar大鼠測(cè)定mMWCNTs的生物安全性。6只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組,通過(guò)自制裝置將3200高斯(Gauss,G)磁鐵分別固定于實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱附近,每3天膀胱灌注一次mMWCNTs(2.5 mg/1 mL),持續(xù)1個(gè)月,另外6只正常飼養(yǎng)的大鼠作為對(duì)照組。1個(gè)月后靜脈分別采集兩組大鼠血液樣本進(jìn)行血清生化檢測(cè),離心分離法(3000轉(zhuǎn)/minx100min)從血液中提取血清樣本,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、血肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)等生化指標(biāo)。解剖并獲取兩組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和大腦等器官,4%多聚甲醛固定,脫水,石蠟包埋,切片染色以檢測(cè)mMWCNTs的全身毒性。EPI的吸附和釋放實(shí)驗(yàn)將EPI以1 mg/mL的濃度溶解于雙蒸水中。將相同質(zhì)量的mMWCNTs超聲30 min,振蕩混合入EPI溶液中,EPI被吸附于mMWCNTs表面制備成mMWCNTs-EPI混懸液。然后將mMWNTs-EPI混懸液靜置于磁力架上,101m/min后,在外部磁場(chǎng)的作用下,mMWCNTs-EPI牢牢地吸附于管壁上,而未被mMWCNTs磁性載體吸附的EPI則游離于溶液中。吸取游離的EPI以高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定EPI濃度并計(jì)算EPI吸附率。EPI吸附率計(jì)算公式如下:吸附率=(總EPI質(zhì)量-游離EPI質(zhì)量)/(EPI總質(zhì)量)x100%然后將制備的mMWCNTs-EPI分別分散于pH=4、6或8的PBS中,置于搖床上。每隔2 h,將混懸液重新置于磁力架上,在外加磁場(chǎng)的作用下將釋放的EPI溶液全部收集,并重新加入pH=4、6或8的PBS溶液(模擬正常排尿規(guī)律)。根據(jù)EPI的濃度變化確定mMWCNTs-EPI釋放EPI的比率,并計(jì)算藥-時(shí)曲線下面積(areas under the concentration-time curves,AUC)。mMWCNTs-EPI的體內(nèi)滯留實(shí)驗(yàn)在3200 G的外加磁場(chǎng)作用下,對(duì)大鼠膀胱內(nèi)mMWCNTs-EPI的滯留時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。用mMWCNTs-EPI分別灌注15只雌性Wistar大鼠,并在灌注后第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只。解剖獲取15只大鼠的膀胱組織,并用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,按照4 pm厚度切片。進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE)染色,觀察mMWCNTs-EPI的體內(nèi)滯留情況。體外實(shí)驗(yàn)定置檢測(cè)細(xì)胞凋亡為了定量測(cè)定細(xì)胞凋亡狀態(tài),5637和T24細(xì)胞被分別種到6孔板中,細(xì)胞的密度均為每孔1×105個(gè)細(xì)胞。第1組為對(duì)照組。第2～4組為實(shí)驗(yàn)組,按照下述方法處理24h:第2組,終濃度為40 pg/mL的mMWCNTs混懸液并外加磁場(chǎng);第3組,終濃度為2pg/mL的EPI溶液;第4組,mMWCNTs-EPI混懸液(EPI的終濃度為2μpg/mL)并外加磁場(chǎng)。分別在第2、4、6、8、10、12、24 h對(duì)所有組更換培養(yǎng)基以模擬正常排尿規(guī)律。收集細(xì)胞,并使用FITC annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行annexin V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色。然后采用FACSDiva流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)定置檢測(cè)細(xì)胞增殖情況為檢測(cè)mMWCNTs對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖情況的影響,5637和T24細(xì)胞被分別種到24孔板中,細(xì)胞的密度均5x104個(gè)細(xì)胞每孔。按照“細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)定”和“體外實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡”兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的分組分別處理細(xì)胞。處理結(jié)束后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均用EdU處理2h,然后室溫下用Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Imaging試劑盒孵育顯像,用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。用熒光顯微鏡采集圖像,然后利用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用EdU陽(yáng)性細(xì)胞核與總細(xì)胞核之比表示。每個(gè)切片拍攝三個(gè)高倍鏡視野,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。化學(xué)方法誘導(dǎo)Wistar大鼠膀胱腫瘤模型本課題根據(jù)文獻(xiàn),采用N-甲基亞硝基脲(N-methy1-N-nitrosourea,MNU)誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤模型。首先,雌性Wistar大鼠腹腔注射3%戊巴比妥(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉。然后,用自制截短的3F硬膜外麻醉導(dǎo)管將膀胱內(nèi)尿液引流干凈,在膀胱內(nèi)灌注MNU(MNU需要在灌注前45 min內(nèi)配制)。每隔一周進(jìn)行一次MNU膀胱灌注,共4次(8周)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mMWCNTs-EPI抗腫瘤活性本研究使用30只雌性Wistair大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。30只大鼠隨機(jī)分為5組。第1組為對(duì)照組,給予正常飲食。第2～5組為實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組大鼠均采用上述化學(xué)方法誘導(dǎo)膀胱腫瘤模型。8周后第2～5組Wistar大鼠分別按照下述方法進(jìn)行膀胱灌注:第2組,0.1 mL PBS溶液;第3組,0.25 mg/0.1 mL mMWCNTs混懸液并外加磁場(chǎng);第4組,0.1 mg/0.1 mL EPI溶液;第5組,0.1 mL mMWCNTs-EPI混懸液(含0.1 mg EPI,0.25 mg mlMWCNTs)并外加磁場(chǎng)。第2～5組Wistar大鼠每周接受1次膀胱灌注,持續(xù)6周。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均予以安樂(lè)死并進(jìn)行尸檢(第3組1只Wistar大鼠死于麻醉意外)。解剖獲取各組大鼠的膀胱、輸尿管和腎臟。記錄每只大鼠腫瘤總體積及每個(gè)腫瘤體積。直徑0.5 mm的病變定義為腫瘤。腫瘤體積計(jì)算按照以下方程計(jì)算:V(mm3)=1/2x長(zhǎng)x寬。免疫組織化學(xué)染色各組膀胱在4%多聚甲醛中固定至少24h,脫水、石蠟包埋、切片,并進(jìn)行Bc1-2、Bax、Cleaved caspase-3免疫組織化學(xué)染色和Ki67免疫熒光染色。陰性對(duì)照不加一抗。利用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行免疫組化圖像分析,利用平均光密度值計(jì)算Bc1-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)量。采用Image J軟件分析Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比率。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究中所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。連續(xù)變量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間的差異通過(guò)單因素方差分析來(lái)比較。組間的多重比較采用Tukey's檢驗(yàn)來(lái)分析。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果mMWCNTs形貌及理化性質(zhì)的表征本研究通過(guò)TEM和FESEM表征了mMWCNTs的形貌。原始MWCNTs的長(zhǎng)度是10～30 μm;經(jīng)過(guò)強(qiáng)酸處理后,MWCNTs-COOH的長(zhǎng)度被剪切為200～1000 nm。近距離觀察發(fā)現(xiàn),MWCNTs-COOH表面緊緊包被納米Fe3O4。mMWCNTs懸浮液的Zeta電勢(shì)為-47.31±0.16 mV,證明其有良好的水溶液穩(wěn)定性。MWCNTs-COOH和mMWCNT的FTIR光譜在3434 cnr1,1626 cm-1,1384 cm-1和1045 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別為O-H鍵,C=O基團(tuán),C-OH鍵和C-O鍵的振動(dòng)峰,說(shuō)明經(jīng)強(qiáng)酸處理后,在多壁碳納米管的表面產(chǎn)生了-COOH和-OH等功能基團(tuán)。此外,mMWCNTs在582 cm-1處的吸收峰為金屬-氧鍵,說(shuō)明mMWCNTs樣品表面成功負(fù)載了磁性Fe3O4納米粒子。X射線衍射進(jìn)一步證實(shí)了mMWCNT中金屬-氧鍵的結(jié)構(gòu)。根據(jù)JCPDS文件(No.190629),mMWCNTs在20=30.16°,35.58°,43.22°°°,53.70°,57.22°和62.87°的六個(gè)衍射峰分別為立方Fe304的(220),(311),(400),(422),(511)和(440)晶面特征峰。此外,mMWCNTs在20二26.02°處的衍射峰為碳納米管石墨片層的(002)晶面特征峰,此峰并非最明顯,這表明mMWCNTs被Fe3O4納米顆粒包裹。本研究采用AGM測(cè)定了mMWCNTs的磁滯曲線。結(jié)果顯示mMWCNTs具有超順磁性,最大飽和磁化強(qiáng)度為19.13 emu/g。殘余磁化率和矯頑力均為零,磁滯曲線呈可逆的S形,樣品中無(wú)遲滯現(xiàn)象。用2 mg/mL的mMWCNTs混懸液觀測(cè)mMWCNTs的宏觀磁性。當(dāng)外加磁場(chǎng)時(shí),mMWCNTs從混懸液中分離,并迅速被磁鐵吸引,混懸液變澄清。當(dāng)mMWCNTs輕微搖晃后又重新回到懸浮狀態(tài)。mMWCNTs混懸液靜置15天后僅觀察到微量mMWCNTs沉積物,表明mMWCNTs在水溶液中的穩(wěn)定性良好。mMWCNTs的生物安全性檢測(cè)本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mMWCNTs的細(xì)胞毒性,終濃度為0.625～40μg/mL的mMWCNTs處理72 h后,均未檢測(cè)到mMWCNTs對(duì)5637和T24細(xì)胞的毒性。本研究通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色,觀察mMWCNTs對(duì)細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白骨架排列及細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示,F-肌動(dòng)蛋白染色主要見(jiàn)于細(xì)胞外膜,胞體內(nèi)亦有少量應(yīng)力纖維。本研究發(fā)現(xiàn),F-肌動(dòng)蛋白纖維在有絲分裂的所有時(shí)期均有所增加。對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組40 μg/mL mMWCNTs處理72 h之后,5637和T24細(xì)胞均未見(jiàn)明顯形態(tài)改變或F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑。本研究通過(guò)計(jì)算EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞比率,檢測(cè)mMWCNTs對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組5637和T24細(xì)胞經(jīng)終濃度為40 μg/mL的mMWCNTs刺激72 h后,與對(duì)照組相比,EdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞比率沒(méi)有明顯改變。結(jié)果證實(shí),mMWCNTs對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響。本研究用12只雌性Wistar大鼠測(cè)定了mMWCNTs的體內(nèi)毒性。結(jié)果顯示,mMWCNTs并無(wú)致死性或全身血生化毒性。在主要臟器中未發(fā)現(xiàn)mMWCNTs的聚集或任何可見(jiàn)的毒性征象(如炎癥細(xì)胞聚集、滲出或其他組織病理學(xué)改變)。12只大鼠均未出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、厭食、嗜睡等異常行為改變,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的體重變化無(wú)明顯差異。EPI的緩釋作用及在大鼠膀觥內(nèi)的滯留效應(yīng)HPLC結(jié)果顯示,單位質(zhì)量mMWCNTs的EPI吸附率為40.4%±9.6%。mMWCNTs-EPI緩慢釋放EPI,與單純應(yīng)用EPI相比,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)釋放EPI的濃度下降較溫和,釋放EPI持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于EPI組。mMWCNTs-EPI持續(xù)釋放EPI使其AUC增加近兩倍。在外加磁場(chǎng)的作用下,Wistar大鼠膀胱灌注mMWCNTs-EPI 12 h后,mMWCNTs-EPI仍能穩(wěn)定存留于大鼠膀胱內(nèi)。隨著時(shí)間的推移,mMWCNTs-EPI的量和mMWCNTs-EPI覆蓋膀胱尿路上皮的面積逐漸減少。膀胱灌注96 h后,mMWCNTs-EPI在大鼠膀胱內(nèi)仍有少量殘余。mMWCNTs-EPI的體外抗腫瘤效應(yīng)CCK-8結(jié)果顯示,模擬排尿規(guī)律,在第2、4、6、8、10、12、24 h更換培養(yǎng)基的條件下,mMWCNTs-EIPI緩釋系統(tǒng)對(duì)5637和T24膀胱腫瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響均大于單純應(yīng)用EPI。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在第2、4、6、8、10、12、24 h更換培養(yǎng)基的條件下,單純應(yīng)用EPI組和mMWCNTs-EPI組5637細(xì)胞和T24細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組和mMWCNTs組。與單純應(yīng)用EPI組相比,mMWCNTs-EPI組細(xì)胞凋亡率明顯升高。EdU染色結(jié)果顯示,在第2、4、6、8、10、12、24h更換培養(yǎng)基的條件下,與單純應(yīng)用EPI組相比,mMWCNTs-EPI組5637細(xì)胞和T24細(xì)胞的EdU標(biāo)記細(xì)胞比率均明顯降低。統(tǒng)計(jì)分析顯示,mMWCNTs-EPI組細(xì)胞增殖率顯著低于單純應(yīng)用EPI組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mMWCNTs-EPI的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)本課題通過(guò)向大鼠膀胱腫瘤模型分別膀胱灌注PBS、mMWCNTs、EPI和mMWCNTs-EPI,研究不同處理對(duì)膀骯腫瘤的抑制作用。無(wú)論評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是每只大鼠的總腫瘤體積還是每個(gè)腫瘤的體積,PBS灌注組和mMWCNTs灌注組對(duì)膀胱腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用均沒(méi)有顯著差異。mMWCNTs-EPI灌注組對(duì)腫瘤的抑制效果優(yōu)于單純灌注EPI組。PBS組和mMWCNTs組均出現(xiàn)1例單側(cè)腎積水;PBS灌注組出現(xiàn)1例雙側(cè)腎積水。腎積水是腫瘤浸潤(rùn)膀胱輸尿管口或累及輸尿管所致。mMWCNTs-EPI促進(jìn)細(xì)胞凋亡免疫組化結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,PBS灌注組和mMWCNTs灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)量降低,而B(niǎo)c1-2的表達(dá)量升高;相比于PBS灌注組,EPI灌注組和mMWCNTs-EPI灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)量升高,而B(niǎo)c1-2的表達(dá)量降低。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示,mMWCNTs-EPI灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)量高于EPI灌注組,而B(niǎo)c1-2的表達(dá)量低于EPI灌注組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示mMWCNTs-EPI灌注組相比于單純灌注EPI組,具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)膀胱腫瘤線粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡的作用。mMWCNTs-EPI抑制細(xì)胞增殖免疫熒光結(jié)果顯示,對(duì)照組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比率很低,而在PBS組和mMWCNTs組,Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯升高。采用單純EPI或mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)膀胱灌注治療后,Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯降低,且mMWCNTs-EPI灌注組對(duì)Ki67表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于EPI組。本研究結(jié)果提示mMWCNTs-EPI灌注組相比于單純灌注EPI組,具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究成功構(gòu)建了一種安全的基于磁性多壁碳納米管的膀胱灌注載藥系統(tǒng)。此系統(tǒng)負(fù)載化療藥物EPI后,形成的mMWCNTs-EPI載藥系統(tǒng)能夠緩釋EPI。在外加磁場(chǎng)的作用下,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)有效延長(zhǎng)了EPI在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)增強(qiáng)了EPI的細(xì)胞毒性,促進(jìn)了膀胱腫瘤線粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡,抑制了膀胱腫瘤細(xì)胞增殖。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)可以利用磁性緩釋和化療的協(xié)同作用,增強(qiáng)膀胱腫瘤的治療效果。
【圖文】：

圖１－１羧基化的小分子碳納米管（ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ）的制備逡逑

ｄ邐丨丨邋ｌ？逡逑ｃｄ逡逑￥邋，，邋＿）逡逑｜邐｜（２２０）ｉ邋（４00）邐（５１１）！逡逑ｖ＇邋Ｗ邋Ｗ邋１｝ＩＪ逡逑１０邋１５邋２０邋２５邋３０邋３５邋４０邋４５邋５０邋５５邋６０邋６５邋７０逡逑２０邋（ｄｅｇｒｅｅ）逡逑圖邋１－６邋ｍＭＷＣＮＴｓ邋的邋ＸＲＤ邋結(jié)果逡逑Ｔｓ在２０邋＝邋２６．０２°處的衍射峰為碳納米管石墨片層的（００２）Ｔｓ在２０邋＝邋３０．１６。，３５．５８。，４３．２２。，５３．７０。，５７．２２。和６２．８７。的方Ｆｅ３0４的（２２０），邋（３１１），邋（４００），邋（４２２），邋（５１１）和（４４０）晶面特征峰。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 閆帥;張贊;楊巍;樊青春;李孝忠;;銩激光在膀胱腫瘤治療中的心得體會(huì)[J];航空航天醫(yī)學(xué)雜志;2019年03期

2 成燕;;淺談膀胱腫瘤患者的疾病獲益感[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2019年26期

3 李坤;高倫祥;;經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)和開(kāi)放手術(shù)治療膀胱腫瘤的療效對(duì)比[J];臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志;2019年32期

4 郎斌;;長(zhǎng)鏈非編碼RNA在膀胱腫瘤中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2017年05期

5 朱存樂(lè);李傳洪;王峰;張寶鵬;羅鋒;王晉龍;;西藏地區(qū)膀胱腫瘤單中心回顧性臨床分析[J];西藏醫(yī)藥;2017年06期

6 祝子清;何露;伍莊;呂艷;吳順理;鄭新民;;經(jīng)尿道等離子“V”型電極膀胱腫瘤整塊切除術(shù)的臨床研究(附29例報(bào)告)[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2018年03期

7 高永亮;;經(jīng)尿道電切術(shù)治療表淺膀胱腫瘤70例報(bào)告[J];實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床;2017年05期

8 鐘曄;劉健;;經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)聯(lián)合膀胱灌注對(duì)膀胱腫瘤的治療價(jià)值評(píng)估[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2015年22期

9 陳志雄;潘翔男;劉永昌;;經(jīng)尿道雙極電切術(shù)聯(lián)合吡柔比星膀胱灌注治療淺表膀胱腫瘤的臨床療效[J];中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué);2015年04期

10 馬占通;;經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療膀胱腫瘤84例的療效觀察[J];臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志;2015年12期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊曉峰;;膀胱腫瘤微創(chuàng)、精準(zhǔn)和靶向外科診療的科學(xué)問(wèn)題和研究策略[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)泌尿外科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第十四次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議暨2016年廣東省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)泌尿外科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

2 肖家全;張琦;劉鋒;祁小龍;章越龍;毛夏娃;章偉;毛祖杰;張大宏;;窄光膀胱鏡聯(lián)合鈥激光治療膀胱腫瘤(附3例報(bào)告)[A];2009年浙江省男科、泌尿外科學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

3 王錫斌;鄒陽(yáng)陽(yáng);;超聲引導(dǎo)對(duì)膀胱腫瘤穿刺活檢的臨床價(jià)值[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

4 魏強(qiáng);鄭碩;李響;李虹;楊宇如;王佳;曾浩;韓平;王坤杰;石明;盧一平;范天勇;陳宗福;;近十一年華西醫(yī)院泌尿外科膀胱腫瘤住院病人的構(gòu)成情況[A];第十六屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

5 丁小波;粱朝朝;蔣云仙;葉元平;劉明;邢江n\;張賢生;郝宗耀;周俊;樊松;邰盛;王克孝;;膀胱腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、意義與資料分析[A];第十六屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

6 余升;;經(jīng)尿道雙極等離子體電切治療淺表膀胱腫瘤15例[A];2013年貴州省泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

7 湯富剛;呂江紅;壽金朵;徐海珊;楊倩;唐海林;潘美;林莎;方凡;趙博文;;腔內(nèi)超聲對(duì)膀胱腫瘤診斷價(jià)值的研究[A];2005年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

8 余賢明;;經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療膀胱腫瘤[A];貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)泌尿外科分會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

9 黃曉飛;吳曉風(fēng);潘克寧;;10例膀胱腫瘤的診治分析[A];2007年貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)泌尿外科分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

10 胡曉華;張子揚(yáng);彭煜;;膀胱腫瘤的手術(shù)方式探討[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 代廷榮;無(wú)痛血尿要防腫瘤[N];中國(guó)石油報(bào);2003年

2 張超群 范曉莉;建立膀胱腫瘤免疫治療動(dòng)物模型[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

3 張紓難;中醫(yī)臨床禁忌系列講座：淋證[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

4 程樹(shù)元;血尿，人體發(fā)出的警告[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2004年

5 安徽省懷寧縣醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)中心 黃芳;尿潴留的簡(jiǎn)易外治[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2009年

6 孫震鵬;膀胱腫瘤術(shù)后灌注前別喝水[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2008年

7 孫健邋胡瓊珍;腹腔鏡下成功根治小兒膀胱腫瘤[N];健康報(bào);2008年

8 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科 陳明　(主任醫(yī)師) 吳葉青;膀胱腫瘤需要做哪些檢查[N];家庭醫(yī)生報(bào);2008年

9 健康時(shí)報(bào)特約記者 劉東邋鄒爭(zhēng)春;可抑制膀胱腫瘤復(fù)發(fā)[N];健康時(shí)報(bào);2007年

10 北京同仁醫(yī)院泌尿外科主任醫(yī)師 劉躍新;膀胱腫瘤早診新技術(shù)[N];健康報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 石小軍;PD-1阻斷聯(lián)合SA-GM-CSF膜錨定膀胱腫瘤干細(xì)胞疫苗治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

2 張慶松;miR-3619-5p通過(guò)作用于β-catenin和CDK2并且激活p21~(WAF1/CIP1)基因抑制膀胱腫瘤[D];華中科技大學(xué);2018年

3 索寧;磁性碳納米管載藥系統(tǒng)緩釋表柔比星在膀胱腫瘤灌注中的療效研究[D];山東大學(xué);2019年

4 鄭凱;Angiostatin對(duì)膀胱腫瘤新生血管抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 鄭連文;BCL-2反義寡核苷酸治療膀胱腫瘤的研究[D];吉林大學(xué);2004年

6 楊登科;結(jié)核桿菌Ag85B/IL-2融合蛋白的原核表達(dá)、純化及其對(duì)膀胱腫瘤免疫治療效應(yīng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 羅軍;NF-κB在膀胱腫瘤細(xì)胞抑制T淋巴細(xì)胞功能中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 劉海濤;分泌IL-2和IFN-α2a的基因重組卡介苗構(gòu)建和抗膀胱腫瘤實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

9 胡向農(nóng);未甲基化CpG寡核苷酸誘導(dǎo)人PBMC抗膀胱腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

10 郭啟振;Survivin在膀胱腫瘤早期診斷，預(yù)后判斷以及細(xì)胞凋亡方面的作用[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄭輝;非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌給予膀胱腫瘤二次電切的臨床療效評(píng)估[D];吉林大學(xué);2019年

2 丁友鵬;經(jīng)尿道雙極等離子針狀電極膀胱腫瘤精準(zhǔn)切除術(shù)治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的初步研究[D];吉林大學(xué);2019年

3 郭偉;薯蕷皂苷元對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的抑制作用的研究[D];武漢大學(xué);2017年

4 謝漢平;經(jīng)尿道激光剜除術(shù)與電切術(shù)治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的臨床研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2019年

5 孫先超;吸煙通過(guò)激活Sonic Hedgehog信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞干性及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

6 張濤;雙硫侖抑制膀胱腫瘤細(xì)胞ALDH1A1的表達(dá)并增強(qiáng)其順鉑敏感性[D];蘭州大學(xué);2019年

7 孔小川;M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的膀胱腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

8 劉坤;超聲對(duì)膀胱腫瘤診斷價(jià)值的評(píng)估[D];大連醫(yī)科大學(xué);2018年

9 王亞輝;膀胱腫瘤病灶內(nèi)miR-21的表達(dá)量變化及其與癌細(xì)胞侵襲、血管新生的潛在相關(guān)性研究[D];蘭州大學(xué);2018年

10 王登殿;姜黃素通過(guò)下調(diào)Shh信號(hào)通路抑制膀胱腫瘤干細(xì)胞活性[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2626888