【摘要】：研究背景:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一。DN的發(fā)病機制目前非常復雜,近年來有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細胞功能障礙會促進DN的發(fā)展。內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)過程中產(chǎn)生的成纖維細胞是腎成纖維細胞的主要來源之一,后者在腎纖維化的過程中發(fā)揮著很大的作用,而腎臟纖維化是DN的主要病理表現(xiàn)。炎癥因子、高糖等能夠促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生EndMT,從而逐步引起所有腎臟細胞纖維化,最終使腎臟失去功能。因此,EndMT在腎臟纖維化過程中起到至關(guān)重要的作用,是內(nèi)皮細胞損傷-纖維化的重要原因和轉(zhuǎn)歸。EndMT在發(fā)生的時候,內(nèi)皮細胞會失去特異性的標志物。例如血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白(vascularendothelialcadherin,VE-cadherin),從而重新獲得了間充質(zhì)細胞的特異性標志,例如波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)等等。盡管目前發(fā)現(xiàn),EndMT可能是導致腎纖維化的重要機制,但其具體調(diào)控尚未清楚。與此同時,內(nèi)皮細胞損傷纖維化會涉及到眾多的分子信號通路,其中Wnt/β-catenin可以進行調(diào)節(jié)參與纖維化進展,此信號通路在腎臟纖維化中的角色地位已經(jīng)得到了許多研究學者的證實。并且有相關(guān)研究證明了 Wnt/β-catenin信號通路途徑和腎臟EMT發(fā)生有關(guān)系,而EndMT實際上就是EMT的一種特殊類型,所以這個角度出發(fā),探索EndMT的調(diào)控機制對防治DN是一個新的方向。中醫(yī)藥制劑腎康丸在一定程度可改善DN,延緩DN進展,但目前并無研究表明腎康丸是否能阻斷EndMT從而更好地治療DN。因而,本實驗使用腎康丸來干預DN纖維化小鼠觀察EndMT及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)指標表達情況,初步探討腎康丸對糖尿病腎病纖維化EndMT的干預療效和初步機制。研究目的:觀察腎康丸對DN小鼠腎纖維化的療效進展,研究腎康丸對EndMT相關(guān)表達蛋白的影響及探討Wnt/β-catenin信號通路在EndMT和促使腎纖維化過程中的作用,以及腎康丸是否能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路,減輕EndMT,對腎纖維化起到治療作用,探索可能機制。研究方法:1、動物分組與造模:選擇7-8周齡的C57小鼠喂養(yǎng),待小鼠完全適應了外周環(huán)境,排除環(huán)境干擾,按隨機分組的方法,抽樣分為正常對照組、DN模型組、中藥高中低干預組、厄貝沙坦對照組進行實驗。每組分10只小鼠,除正常對照組外其余小鼠進行DN造模,利用STZ建立小鼠糖尿病模型,將STZ溶解于O.1mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中。向小鼠右側(cè)腹腔中一次性注射STZ(37.5mg·kg-1),若血糖值高于16.7 mol·L-1、尿量明顯增加,則造模成功,計算成模率。造模后分別灌胃給藥治療8周。治療期間及治療后觀察小鼠一般狀況、血糖、體重。2、末次給藥后將小鼠放入代謝籠中,計24h尿量。然后將小鼠用苯巴比妥鈉按照250mg/kg進行腹腔注射麻醉,眼眶采血,分離血清,檢測小鼠24h尿白蛋白量、血肌酐、尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率等數(shù)值情況3、HE、MASSON染色觀察組織糖尿病腎臟病理和纖維化程度,觀察每組之間的病理變化。4、使用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot,WB)檢測觀察標記物α-sma、vimentin、VE-cadheri在組織中的蛋白表達量。5、RT-PCR、WB 檢測 Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β的 mRNA 和蛋白表達,各組之間進行比較。結(jié)果:1、50只小鼠用于造模,成模率92.0%(46/50),成模后病死率8.6%(4/46)。在治療期間的8周里,模型組小鼠血糖均維持在16.7mmol·L-1以上,表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的癥狀;與模型組相比,腎康丸組和厄貝沙坦組的血糖有不同程度的下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與正常小鼠相比,模型組24h尿蛋白定量明顯高于正常組,具有統(tǒng)計學意義(P0.05),腎康丸中、高劑量組24h尿蛋白定量明顯低于模型組,具有統(tǒng)計學意義(P0.05);模型組與正常組比較,BUN、Scr明顯升高,Ccr顯著下降,有統(tǒng)計學意義(P0.05);腎康丸中、高劑量組與模型組比較,BUN、Scr顯著降低,Ccr明顯升高,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、HE染色提示正常組的腎臟組織表現(xiàn)正常,系膜基質(zhì)分布未見明顯增多。模型組小鼠腎臟組織出現(xiàn)系膜基質(zhì)增多,囊腔狹窄。厄貝沙坦組、腎康丸低、中、高劑量組處理后病理改變減輕,系膜區(qū)基質(zhì)增生減少。Masson染色顯示,模型組染色呈強陽性,纖維組織片狀增生,明顯纖維化;各用藥干預組纖維組織增生少量分布,纖維化程度不同程度減弱。3、免疫組化和WB結(jié)果提示和正常組相比,模型組的α-sma、vimentin蛋白表達量會升高,VE-cadherin表達量降低。而與模型組比較,厄貝沙坦組、腎康丸低、中、高劑量組的α-sma、vimentin表達量降低、E-cadherin表達量升高。4、RT-PCR和WB結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組的腎組織Wntl、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白明顯增多(p0.05);而與模型組比較,腎康丸干預后的小鼠腎臟中的腎組織Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白均低于模型組(P0.05)。厄貝沙坦組與腎康丸組之間無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:Wnt/β-catenin信號通路活化參與DN小鼠腎纖維化的發(fā)病過程,腎康丸可以改善DN模型小鼠的腎功能,抑制腎臟纖維化。其機制可能會通過下調(diào)Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β等的表達,抑制Wnt/β-catenin通路活化,從而上調(diào)VE-cadherin表達,減少α-SMA、Vimentin表達,從而抑制EndMT,起到抗腎纖維化的作用。腎康丸可以通過調(diào)控β-catenin來抑制EndMT的發(fā)展從而阻止和延緩腎纖維化進展,為DN的治療提供新的研究機制。
【圖文】：

具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜0．邋０５）。同模型組相比較，中藥干預組和厄貝沙逡逑坦對照組的ａ＿ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表達相對減少，而ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表達則逡逑增多，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜0．邋０５）。（見圖５、圖６）逡逑圖５：各組小鼠腎臟組織中ａ－ＳＭＡ，，邋ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白表達逡逑Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ－ＳＭＡ，邋ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，邋Ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋Ｋｉｄｎｅｙ邋Ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ａｌｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ逡逑ＧＡＰＤＨ逡逑ａ－ＳＭＡ逡逑ＶＥ－ｃ＾ｄｈｅｒｍｖ邐＼逡逑Ｖｉｍｅｎｔｉｎ邐屸邋，松一洲＿？？ｉ邐“}0蒙嘛V/—一逡逑紐逡逑ＮＣ邋ＭＯＤ邋Ｌ邋Ｍ邋Ｈ邋Ｅ逡逑，邋８ｉ逡逑蛋邐ｓ邐■ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑＾邐６－邐＊邐＿邐＿邋ｍｏｄｅｌ逡逑１邐ＪＪｌｌｉＬｉｌｉ邐Ｊｌ邐１１邐＆逡逑圖６各組小鼠腎臟組織中ａ－ＳＭＡ，ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白表達逡逑注：與正常組比較，卞＜０．０５；與模型組比較，

ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ的蛋白含量表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（ＰＣ０．０５）。逡逑而與模型組對比較，腎康丸干預各組和厄貝沙坦對照組的上述蛋白含量表達均逡逑低于模型組的表達，具有統(tǒng)計學意義（Ｐ＜0．邋０５）。（如圖８、圖９所示）。逡逑圖８：各組小鼠腎臟組織中ｆｆｎｔｌ、Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ蛋白表達情況逡逑Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｗｎｔｌ，邋Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ａｎｄ邋Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋Ｋｉｄｎｅｙ邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋Ａｌｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ逡逑Ｗｎｔｌ邐咖邐ｒｎｍｍｍ逡逑Ｂ—ｃａｔｅｎｌｎ逡逑廣．ｖＷｖＷＶＷｖＶｖ逡逑Ｐ－ＧＳＫ－３＾邐？—逡逑ｊ逡逑Ｎ邋Ｍ邋Ｌ邋Ｍ邋Ｈ邋Ｅ逡逑Ｃ邋０逡逑Ｄ逡逑８－ｉ邐．逡逑ｔ邐■■邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑？邐．邐ｌｉ：邋ｆ邐Ｍ邐Ｍｏｄｅｌ逡逑ｆ邋ｉ（邐－Ｌ逡逑１邋Ｉｊｉｉｉｉｉｉｌｉｉｒ逡逑＾邐＾逡逑圖９各組小鼠腎臟組織中Ｗｎｔｌ、Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ蛋白表達情況逡逑注：與正常組比較，ＢＰ＜０．０５；與模型組比較，叩＜０．０５逡逑３３逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 Jean Jacques N Noubiap;Jashira Naidoo;Andre P Kengne;;Diabetic nephropathy in Africa:A systematic review[J];World Journal of Diabetes;2015年05期

2 閆U

本文編號：2618231