發(fā)布時(shí)間：2020-03-30 17:17

【摘要】：目的:高血壓與勃起障礙(ED)關(guān)系密切,主要影響的信號(hào)通路有eNOS/NO信號(hào)通路和RhoA/Rho激酶信號(hào)通路。本課題前期已證明在高血壓狀態(tài)下存在eNOS/NO信號(hào)通路下調(diào)及RhoA/Rho激酶信號(hào)通路上調(diào)。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate S1P)參與eNOS、RhoA/Rho激酶的上游調(diào)控。S1P是一類(lèi)具有生物活性的鞘脂介質(zhì),可以與其對(duì)應(yīng)的S1P受體相結(jié)合,通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型的生物調(diào)控作用,參與調(diào)節(jié)血管張力,引起血管的收縮和擴(kuò)張。目前已知的S1P受體亞型有5個(gè),其中1-磷酸鞘氨醇受體-1(sphingosine-1-phosphate 1 S1P1)在eNOS介導(dǎo)的血管舒張中有重要作用,其機(jī)制可能是通過(guò)P13k/Akt信號(hào)通路磷酸化eNOS第1177位點(diǎn)的ser后活化體內(nèi)的eNOS,從而促進(jìn)NO的生物合成及釋放,改善勃起功能。而上調(diào)高血壓大鼠(SHR)陰莖海綿體中S1P1的表達(dá)能否改善其勃起功能目前尚不清楚。本研究探討上調(diào)SHR大鼠陰莖海綿體中S1P1的表達(dá)與勃起功能的關(guān)系,闡述高表達(dá)的S1P1與eNOS/NO、RhoA/Rho激酶信號(hào)通路之間的關(guān)系。方法:成年健康雄性正常高血壓(WKY)大鼠10只隨機(jī)分為WKY組和WKY轉(zhuǎn)染組;成年健康雄性SHR大鼠10只隨機(jī)分為SHR組和SHR轉(zhuǎn)染組。各組大鼠均為12周齡大小,體重約為260-300g。以1%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉WKY轉(zhuǎn)染組和SHR轉(zhuǎn)染組,將攜帶S1P1基因的慢病毒注射到大鼠陰莖海綿體兩側(cè)內(nèi),慢病毒滴度1x10~9TU/ml,每只大鼠各注射10μl,仔細(xì)觀察大鼠反應(yīng)情況,待大鼠清醒后放回籠中,繼續(xù)飼養(yǎng)一周。慢病毒轉(zhuǎn)染后一周進(jìn)行ICPmax/MAP值測(cè)定、采血及取陰莖海綿體組織:麻醉前稱(chēng)重各組大鼠計(jì)算麻醉劑量(以1%戊巴比妥鈉30mg/Kg計(jì)算),將計(jì)算好的麻醉劑注射到大鼠腹腔進(jìn)行麻醉,將麻醉好的大鼠固定于手術(shù)操作臺(tái),手術(shù)分離及暴露大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈,在26G針頭內(nèi)注滿肝素生理鹽水進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈穿刺,針頭另一側(cè)連接好壓力換能器,連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠頸總動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓(MAP)的變化。接著在24G針頭內(nèi)注滿肝素生理鹽水插入大鼠陰莖海綿體內(nèi),針頭另一側(cè)連接壓力換能器,分別用刺激強(qiáng)度0V、3V、5V,波幅5ms,刺激頻率12Hz,給予海綿體盆神經(jīng)節(jié)不同強(qiáng)度的電刺激,持續(xù)刺激時(shí)間45s/次,刺激時(shí)間間隔5min,并記錄各組大鼠ICPmax/MAP值。待ICPmax/MAP值測(cè)定完畢后手術(shù)取下大鼠陰莖海綿體并用生理鹽水仔細(xì)清洗,在頸總動(dòng)脈處采血2ml用于檢測(cè)各組大鼠血清睪酮(T)水平。取下的各組大鼠海綿體組織分為四個(gè)部分,分別用于熒光染色、Western-blot實(shí)驗(yàn)分析、免疫組化分析、生化檢測(cè)海綿體中一氧化氮(NO)的含量。其中Western-blot印跡方法和免疫組化分別檢測(cè)大鼠陰莖海綿體中eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1五個(gè)指標(biāo)的蛋白表達(dá)。結(jié)果:ICPmax/MAP:在0V、3V、5V下SHR組(0.046±0.009、0.223±0.027、0.298±0.020)較WKY組(0.155±0.015、0.712±0.029、0.765±0.020)顯著降低(P0.01),SHR轉(zhuǎn)染組(0.093±0.006、0.656±0.046、0.744±0.045)較SHR組顯著升高(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組(0.187±0.041、0.768±0.046、0.814±0.042)較WKY組無(wú)明顯變化。血清睪酮水平WKY組(417.24±22.21ng/dl),SHR組(409.95±11.8ng/dl),WKY轉(zhuǎn)染組(428.82±19.85ng/dl),SHR轉(zhuǎn)染組(415.47±11.5ng/dl)各組無(wú)明顯差異。熒光染色顯示各組攜帶S1P1基因的慢病毒分布,轉(zhuǎn)染部位為陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞,根據(jù)圖片分析IOD值半定量,WKY轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染率為(86.15±4.02)%,SHR轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染率為(89.39±3.14)%。Western blot印跡分析各組大鼠海綿體中eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1蛋白條帶,將各個(gè)指標(biāo)目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)比值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析:SHR組和SHR轉(zhuǎn)染組S1P1、P-eNOS蛋白表達(dá)較WKY組和WKY轉(zhuǎn)染組降低(P0.05),SHR轉(zhuǎn)染組較SHR組顯著升高(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組較WKY組顯著升高(P0.01);SHR組和SHR轉(zhuǎn)染組ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)較WKY組和WKY轉(zhuǎn)染組顯著升高(P0.05),SHR轉(zhuǎn)染組較SHR組顯著降低(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組較WKY組顯著降低(P0.01),各組eNOS無(wú)明顯變化。免疫組化定位各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)eNOS、P-eNOS、ROCK1、ROCK2、S1P1:血管內(nèi)皮細(xì)胞和海綿竇血管腔內(nèi)主要表達(dá)eNOS,血管內(nèi)皮細(xì)胞和海綿竇腔內(nèi)主要表達(dá)P-eNOS,海綿體血管平滑肌細(xì)胞胞漿主要表達(dá)ROCK1、ROCK2,血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)S1P1。采用積分光密度值(IOD)表示進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,SHR組和SHR轉(zhuǎn)染組S1P1、P-eNOS的表達(dá)較WKY組和WKY轉(zhuǎn)染組降低(P0.05),SHR轉(zhuǎn)染組較SHR組顯著升高(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組較WKY組顯著升高(P0.01);SHR組和SHR轉(zhuǎn)染組ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)較WKY組和WKY轉(zhuǎn)染組顯著升高(P0.05),SHR轉(zhuǎn)染組較SHR組顯著降低(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組較WKY組顯著降低(P0.01),各組eNOS無(wú)明顯變化。海綿體中NO含量WKY組(3.95±0.1umol/gprot),SHR組(2.42±0.29umol/gprot),WKY轉(zhuǎn)染組(5.22±0.18umol/gprot),SHR轉(zhuǎn)染組(3.26±0.44umol/gprotl)。SHR轉(zhuǎn)染組較SHR組NO含量明顯升高(P0.01),WKY轉(zhuǎn)染組較WKY組NO含量明顯升高(P0.01)。結(jié)論:上調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠陰莖海綿體中S1P1的表達(dá),可能通過(guò)促進(jìn)eNOS/NO信號(hào)通路并抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路改善勃起功能。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R544.1;R698

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