【摘要】：目的:研究阿魏酸拮抗人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用。方法:以HK-2細(xì)胞為研究對象,采用不同濃度(1、5、10 ng/mL)轉(zhuǎn)化生長因子-b1(TGF-b1)刺激細(xì)胞不同時間(12、24、48、72 h),通過觀察細(xì)胞形態(tài)及a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)熒光強度篩選出建立HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞(模型細(xì)胞)的最適條件,即TGF-b1的濃度及時間。再予不同濃度(125mmol/L、250mmol/L、500mmol/L)阿魏酸干預(yù)模型細(xì)胞,顯微鏡下觀察阿魏酸對模型細(xì)胞形態(tài)的影響,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞上清液纖維連接蛋白(Fn)、I型膠原蛋白(Col I)表達(dá)水平,蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞α-SMA、整合素連接激酶(ILK)蛋白質(zhì)表達(dá)水平;實時熒光定量(qPCR)方法檢測α-SMA、Fn、Col I、ILK mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:(1)10 ng/mL TGF-β1干預(yù)HK-2細(xì)胞24 h,細(xì)胞形態(tài)由橢圓形或多邊形變?yōu)殚L梭形,形態(tài)改變最為明顯,免疫熒光檢測的α-SMA蛋白陽性信號表達(dá)最強。(2)阿魏酸對模型細(xì)胞形態(tài)的影響:對照組細(xì)胞為橢圓形或多邊形;模型組細(xì)胞為長梭形;低、中、高劑量阿魏酸組,細(xì)胞形態(tài)趨向?qū)φ战M。(3)阿魏酸對模型細(xì)胞α-SMA、Fn、Col I、ILK、α-SMA蛋白表達(dá)水平的影響:免疫熒光檢測各組細(xì)胞α-SMA蛋白陽性信號,模型組陽性信號最強,低、中、高劑量阿魏酸組細(xì)胞的α-SMA蛋白陽性信號隨阿魏酸濃度的增加而減弱。ELISA檢測細(xì)胞上清液Fn、Col I蛋白表達(dá)水平:對照組、模型組、阿魏酸低劑量組、阿魏酸中劑量組及阿魏酸高劑量組Fn蛋白質(zhì)表達(dá)水平分別為(138.57±14.99)pg/mL、(554.82±7.83)pg/mL、(491.16±9.69)pg/mL、(270.23±18.47)pg/mL、(195.99±5.91)pg/mL(P0.01),Col I蛋白質(zhì)表達(dá)水平分別為(1418.60±154.08)pg/mL、(6652.40±458.53)pg/mL、(5430.77±227.28)pg/mL、(4424.77±329.92)pg/mL、(2279.07±369.12)pg/mL(P0.01)。Western blot檢測細(xì)胞α-SMA、ILK蛋白表達(dá)水平:對照組、模型組、阿魏酸低劑量組、阿魏酸中劑量組及阿魏酸高劑量組α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)水平分別為0.14±0.01、0.40±0.01、0.36±0.01、0.23±0.01、0.16±0.01(P0.01),ILK蛋白質(zhì)表達(dá)水平分別為0.14±0.02、0.46±0.02、0.38±0.01、0.33±0.01、0.29±0.01(P0.01)。(4)阿魏酸對模型細(xì)胞α-SMA、Fn、Col I、ILK mRNA表達(dá)水平的影響:對照組、模型組、阿魏酸低劑量組、阿魏酸中劑量組及阿魏酸高劑量組α-SMA mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.72±0.14、1.38±0.10、1.20±0.08、1.00±0.08(P0.01),Fn mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.96±0.21、1.95±0.15、1.69±0.13、1.26±0.05(P0.01),Col I mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.96±0.12、2.62±0.05、1.79±0.07、1.17±0.04(P0.01),ILK mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.31±0.16、1.78±0.11、1.55±0.11、1.29±0.09(P0.01)。(5)ILK蛋白質(zhì)表達(dá)水平與Fn、Col I、α-SMA蛋白質(zhì)相關(guān)性分析:ILK與Fn、Col I、α-SMA均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.897(P0.05)、0.938(P0.05)、0.890(P0.05)。結(jié)論:(1)10 ng/mL TGF-b1刺激HK-2細(xì)胞24 h是TGF-b1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的較好條件。(2)阿魏酸下調(diào)模型組細(xì)胞ILK、Fn、Col I、α-SMA的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平,阻抑TGF-b1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。(3)阿魏酸拮抗HK-2細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用可能與抑制TGF-β1的下游信號因子ILK有關(guān)。
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果K-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞模型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型最適 TGF-β1 濃度篩選不同濃度的 TGF-β1 刺激下細(xì)胞形態(tài)變化K-2 細(xì)胞生長 24 h 后，形成融合的單層上皮細(xì)胞，顯微鏡下呈有上皮細(xì)胞典型的鋪路石樣的形態(tài)（圖 1A）。分別予 1ng/mLTGF-β1 干預(yù) HK-2 細(xì)胞 24 h，細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)不同程度的改形態(tài)由橢圓形或多邊形逐漸拉長為梭形，細(xì)胞間排列逐漸疏圖 3.1B、3.1C、3.1D），10 ng/mL 組細(xì)胞形態(tài)改變最為明顯（g/mL 的 TGF- 1 對 HK-2 細(xì)胞形態(tài)影響最為明顯。

不同濃度 TGF-β1 對 HK-2 細(xì)胞 -SMA 表達(dá)的影響（ 400，標(biāo)尺：光為 -SMA 陽性表達(dá)。A：對照組； B：1 ng/mL TGF- 1 組；C：5 ngg/mL TGF- 1 組。對照組細(xì)胞呈現(xiàn)較弱的 -SMA 蛋白陽性信號表達(dá)（/mL（C）、10 ng/mL（D）組細(xì)胞 -SMA 蛋白陽性信號表達(dá)逐漸增強，MA 蛋白陽性信號表達(dá)最強（D）。細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型最適 TGF-β1 作用時間篩選不同時間 TGF-β1 作用對細(xì)胞形態(tài)的影響 ng/mL TGF-β1 處理 HK-2 細(xì)胞，12 h 后顯微鏡下觀察細(xì)胞大邊形的正常上皮細(xì)胞形態(tài)，，少部分細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形（圖 3.3A，大部分細(xì)胞變?yōu)殚L梭形，并且細(xì)胞間排列疏松（圖 3.3B、3.g/mL TGF-β1 刺激細(xì)胞 24 h 即具有較強的促進細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692

【參考文獻】

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本文編號：2604420