【摘要】：目的:增強(qiáng)子是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件,可以增加靶基因的表達(dá)。據(jù)報(bào)道增強(qiáng)子受到刺激后可以轉(zhuǎn)錄生成功能性的RNAs,即增強(qiáng)子RNAs(Enhancer RNAs,e RNAs)。越來(lái)越多的證據(jù)表明e RNAs參與了包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。嘌呤受體P2Y2(Purinergic receptor P2Y2,P2RY2)是G蛋白偶聯(lián)嘌呤受體的典型代表,廣泛分布于正常組織中。膀胱癌中存在性別差異,說(shuō)明雌激素在膀胱癌中發(fā)揮重要作用,P2RY2增強(qiáng)子RNA(P2RY2 enhancer RNA,e P2RY2)是一種雌激素反應(yīng)性e RNA,本研究主要探討e P2RY2與雌激素的關(guān)系及其在膀胱癌中的作用。方法:本研究采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-q PCR)法檢測(cè)膀胱癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中e P2RY2的相對(duì)表達(dá)水平。使用雌激素誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞中e P2RY2的表達(dá),并用RT-q PCR法檢測(cè)其表達(dá)變化情況;采用小干擾RNA和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列-關(guān)聯(lián)蛋白13a(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)系統(tǒng)敲低膀胱癌細(xì)胞中的e P2RY2,通過(guò)RT-q PCR法檢測(cè)并對(duì)比二者的敲低效率。通過(guò)EDU試劑盒和CCK8試劑盒檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力,通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的遷移能力,通過(guò)人胱天蛋白酶3(Caspase-3)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞的凋亡能力。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計(jì)分析均由SPSS 17進(jìn)行。結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)相較于癌旁組織,e P2RY2在膀胱癌組織表達(dá)升高,且e P2RY2高表達(dá)與膀胱癌患者的組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān)。在膀胱癌細(xì)胞中,CRISPR-Cas13a系統(tǒng)敲低e P2RY2的效率顯著高于小干擾RNA,雌激素處理后的膀胱癌細(xì)胞e P2RY2表達(dá)升高。此外雌激素促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,抑制了膀胱癌細(xì)胞的凋亡能力,而用CRISPR-Cas13a系統(tǒng)敲低e P2RY2后,膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力被抑制,膀胱癌細(xì)胞凋亡增加。更重要的是,本研究證明了e P2RY2下調(diào)會(huì)削弱雌激素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的惡性潛能的促進(jìn)作用。結(jié)論:綜上所述,雌激素和e P2RY2在膀胱癌中發(fā)揮促癌作用,并且雌激素可能通過(guò)誘導(dǎo)e P2RY2的生成來(lái)促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。此外,相較于小干擾RNA,CRISPR-Cas13a系統(tǒng)更適用于e P2RY2在腫瘤領(lǐng)域中的敲低研究。本文以全新的角度闡述了雌激素在膀胱癌中的作用機(jī)制,詮釋了引起膀胱癌中的性別差異的分子通路,為膀胱癌的早期預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

活性增強(qiáng)子雙向轉(zhuǎn)錄生成eRNAs

eRNAs 可以通過(guò)改變?cè)鰪?qiáng)子上的組蛋白修飾影響其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力REB 結(jié)合蛋白（CREB binding protein，CBP）與大量轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成轉(zhuǎn)控網(wǎng)絡(luò)，幾乎可以與所有增強(qiáng)子結(jié)合[44]，這使得 CBP 成為增強(qiáng)子的標(biāo)志之,46]。eRNAs 可與 CBP 結(jié)合以調(diào)節(jié)乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，進(jìn)而增加 H3K27ac，促進(jìn)子活性，，上調(diào)相應(yīng)基因的表達(dá)[47]。溴結(jié)構(gòu)域蛋白（BRD4）是 BET 蛋白家族員，通過(guò)與乙�；慕M蛋白的相互作用協(xié)助 mRNAs 和 eRNAs 的延伸[48]。經(jīng)多糖處理的原代單核細(xì)胞的增強(qiáng)子區(qū)域 H3K4me2 和 H3K27ac 增加，并且通義寡核苷酸技術(shù)敲低 eRNAs 可以影響組蛋白修飾[33]。eRNAs 還與轉(zhuǎn)錄抑制過(guò)的組蛋白修飾密切相關(guān)，核受體 Rev-Erbs 在共抑制因子組蛋白去乙�；疦CoR）-HDAC3 復(fù)合物的輔助下抑制轉(zhuǎn)錄，其與增強(qiáng)子結(jié)合后，eRNAs 和組 3 賴(lài)氨酸 9 乙�；℉istone 3 lysine 9 acetylation，H3K9ac）的水平均降低ev-Erbs 的敲除可抵消對(duì)相關(guān)增強(qiáng)子產(chǎn)生 eRNAs 的抑制[49]。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2601002