發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 06:38

【摘要】：蛋白質(zhì)糖基化修飾是最復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在生命過程中發(fā)揮重要的功能。常見的蛋白質(zhì)糖基化修飾包括:N-糖基化、O-GalNAc糖基化和O-GlcNAc糖基化等,其結(jié)構(gòu)多樣,分布廣泛,并以多種方式參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞-細(xì)胞間以及宿主-病原體相互作用等基本生物學(xué)過程。其異常變化與免疫性疾病、腫瘤、先天性糖缺陷等重要疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此,糖基化作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn),一直受到廣泛關(guān)注。本文研究重點(diǎn)為糖蛋白質(zhì)組學(xué)新方法及其在IgA腎病中的應(yīng)用研究,包括正常人、非新月體和新月體IgA腎病患者血漿IgA1的N-糖鏈與O-糖基化肽段定性定量比較分析,正常人和IgA腎病患者血漿定量O-糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析,以及基于氮化碳基底的糖肽高效富集新材料的開發(fā)和應(yīng)用。本論文由四部分組成。第一章:我們概述了蛋白質(zhì)糖基化修飾的基本概念、研究方法和生物學(xué)功能,綜述了IgA腎病中的IgA1糖基化的研究現(xiàn)狀、糖基化修飾方法學(xué)難點(diǎn)以及基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組研究現(xiàn)狀,包括血漿O-糖蛋白質(zhì)組的研究現(xiàn)狀、糖蛋白或糖肽富集技術(shù)的研究現(xiàn)狀。第二章:IgA腎病(IgAN)是世界范圍內(nèi)常見的原發(fā)性腎小球疾病,以腎小球系膜區(qū)IgA1沉積和持續(xù)發(fā)炎為典型免疫病理特征,新月體IgA腎病是其中最嚴(yán)重的一型。以前的研究表明IgAN患者血漿中的IgA1的糖修飾會(huì)發(fā)生異常,但是沒有區(qū)分單體和多聚體IgA1的糖基化,也沒有對(duì)糖鏈和糖肽豐度變化進(jìn)行系統(tǒng)性研究。為此,我們建立了簡(jiǎn)單快速且重復(fù)性好的單體IgA1(mIgA1)和多聚體IgA1(p IgA1)樣品制備方法和生物質(zhì)譜糖修飾系統(tǒng)性分析方法,并對(duì)12例正常人、11例非新月體IgAN患者以及11例新月體IgAN患者血漿中的mIgA1和p IgA1的N-糖鏈以及完整O-糖基化肽段進(jìn)行了定性定量比較分析,發(fā)現(xiàn)mIgA1和pIgA1的糖基化修飾(如高甘露糖型)存在差異,在健康人、非新月體和新月體IgAN患者血漿mIgA1中發(fā)現(xiàn)了4條N-糖鏈和13條完整O-糖基化肽段表達(dá)具有顯著差異(P0.01),在健康人、非新月體和新月體IgAN患者血漿pIgA1中發(fā)現(xiàn)4條N-糖鏈和17條完整O-糖基化肽段表達(dá)具有顯著差異(P0.01)。這些差異顯著的糖鏈和糖肽可能作為潛在的疾病診斷標(biāo)志物或者治療靶標(biāo),并為IgA腎病的分型和發(fā)病機(jī)制解釋提供依據(jù)。第三章:O-糖基化蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化與人類疾病如癌癥、炎癥和退行性疾病等相關(guān)。為了發(fā)現(xiàn)IgAN患者血漿中異常表達(dá)的O-糖蛋白/肽段,并作為潛在生物標(biāo)記物用于IgA腎病的分型和診斷,我們進(jìn)行了位點(diǎn)特異性O(shè)-糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究。但是由于O-糖基化修飾的微觀不均一性和宏觀不均一性,人血漿中的位點(diǎn)特異性O(shè)-糖基化分析仍然具有挑戰(zhàn)性。為此,我們發(fā)展了一個(gè)系統(tǒng)性分析策略,該策略結(jié)合多酶酶切、多維分離的樣品制備、高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜鑒定以及Byonic軟件分析,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)完整的O-糖肽進(jìn)行表征。結(jié)果表明,多酶酶切或多維分離可以使樣品制備更加有效,EThcD碎裂模式不僅適用于單位點(diǎn)修飾的O-糖基化肽段(50.3%)的鑒定,而且還適用于二重(21.2%)和三重(28.5%)位點(diǎn)修飾的O-糖基化肽段的鑒定。使用嚴(yán)格的打分標(biāo)準(zhǔn),在人血漿中鑒定出源于49個(gè)O-糖蛋白的499條非冗余完整O-糖肽,173個(gè)O-糖基化位點(diǎn)和6種O-糖鏈,其中包括121個(gè)新的O-糖基化位點(diǎn)。這是目前人血漿樣品的位點(diǎn)特異性O(shè)-糖蛋白組的最大數(shù)據(jù)集。這項(xiàng)研究開發(fā)的策略有助于深入分析人血漿中的O-糖蛋白,為了解蛋白質(zhì)O-糖基化在人類健康和疾病(IgA腎病)中的功能奠定基礎(chǔ)。此外,還建立了基于雙甲基標(biāo)記的定量O-糖蛋白度質(zhì)組學(xué)方法,并應(yīng)用于IgA腎病血漿O-糖蛋白組研究,發(fā)現(xiàn)了差異的O-糖基化蛋白和肽段,可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),是潛在的生物標(biāo)志物。第四章:糖肽在蛋白質(zhì)中化學(xué)計(jì)量很低,從復(fù)雜生物樣品中直接檢測(cè)糖肽十分困難,因而,糖肽富集是深度覆蓋糖蛋白組的關(guān)鍵步驟。商業(yè)化糖肽富集材料HILIC特異性和富集效率并不足夠高,因而需要開發(fā)一種高特異性和高富集效率的糖肽富集材料。在本章中,我們制備了一種新的自組裝親水苯硼酸功能化的薄層C_3N_4材料(MPBA-Au@s-C_3N_4,MASC),該材料可基于B-N之間的協(xié)同效應(yīng)來增強(qiáng)對(duì)糖肽的親和力,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的有效富集。采用XPS光譜、Zeta電位測(cè)試和茜素紅S(ARS)顯色反應(yīng)對(duì)該材料進(jìn)行了表征,證明了B-N鍵的存在。采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白IgG以及辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)該材料的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià),表明該材料對(duì)糖肽的富集具有優(yōu)越的性能,包括低pH適應(yīng)、親水性、穩(wěn)定性、重復(fù)性和可循環(huán)利用性、高選擇性(1:100)、低檢測(cè)限(0.33 fmol/μL)、高富集效率(~80%)和高回收率(~90%)。該材料也被成功地分別應(yīng)用于從標(biāo)準(zhǔn)蛋白和復(fù)雜樣品中無偏性地捕獲糖肽,鑒定了來自IgG的37條糖肽和HRP的21條糖肽。該材料用于人尿糖肽的富集,分別從女性和男性尿液樣品中鑒定出來自839個(gè)糖蛋白的1465條糖肽和來自884個(gè)糖蛋白的1553條糖肽。還從5μL的人血漿中鑒定到209種糖蛋白的463條糖肽。證明新型材料MASC可有效富集人血液和尿液中的糖肽,有可能應(yīng)用于IgA腎病等疾病糖肽標(biāo)志物的篩選研究,在蛋白質(zhì)糖基化研究領(lǐng)域有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文14]。在腫瘤細(xì)胞中，O-GalNAc 糖基化會(huì)異常改變，產(chǎn)生截短型 O-糖，Tn 抗原），開發(fā)靶向這些 O-糖鏈的疫苗，為癌癥治療提供了新的思路cNAc 糖基化與多種翻譯后修飾如磷酸化之間存在相互作用[16, 17]，共的活性與功能，作為壓力感受器和營(yíng)養(yǎng)感受器發(fā)揮重要作用[18, 19]。和癌組織中發(fā)現(xiàn) OGT 上調(diào)，OGA 下調(diào)，，導(dǎo)致 O-GlcNAc 糖基化修飾水升[20, 21]。

包括含量最多的單體 IgA1（mIgA1），少量的多聚體（pIgA1）。IgA1 的結(jié)構(gòu)如圖1.2 所示[34]，其含有兩條重鏈和輕鏈，在重鏈 Cα1 和 Cα2 之間存在一個(gè)由 19 個(gè)氨基酸組成的鉸鏈區(qū)（HR），該鉸鏈區(qū)富含 Ser、Thr 和 Pro，存在 9 個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，通常 3~6 個(gè)位點(diǎn)同時(shí)被單/雙唾液酸核心 1 結(jié)構(gòu)或 Tn 抗原所修飾[35]。在重鏈 Cα2 和 Cα3 上各自存在一個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，分別是 Asn263 和Asn459[36]。在人類免疫球蛋白中，絕大多數(shù)都會(huì)發(fā)生 N-糖基化，但是目前只發(fā)現(xiàn) IgA1、IgG3 和 IgD 的鉸鏈區(qū)會(huì)發(fā)生 O-糖基化[37, 38]。在 IgAN 小鼠模型（β4Gal9-Ⅰ缺陷小鼠）中
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692.31

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本文編號(hào)：2597955