【摘要】：目的:研究RCAS1含量升高或降低對(duì)于Pca細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,揭示RCAS1在Pca發(fā)生、進(jìn)展中的作用,初步判斷RCAS1在Pca早期診療中的臨床應(yīng)用可能,并積極探索RCAS1靶向基因治療的價(jià)值。方法:體外培養(yǎng)PC3、LNCaP、C42、DU145等前列腺癌常見細(xì)胞系,并通過qPCR及Western Blot檢測(cè)RCAS1表達(dá)狀態(tài),篩選RCAS1高、低表達(dá)細(xì)胞系。構(gòu)建RCAS1高表達(dá)質(zhì)粒RCAS1-high并通過基因測(cè)序技術(shù)確定質(zhì)粒無突變,將RCAS1-high瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RCAS1低表達(dá)細(xì)胞系,應(yīng)用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表達(dá)量,確定RCAS1-high可在細(xì)胞內(nèi)完整表達(dá)。購(gòu)買吉瑪公司shRCAS1質(zhì)粒套餐,篩選出RCAS1高表達(dá)細(xì)胞并瞬轉(zhuǎn),48h后使用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表達(dá)量并最終篩選出抑制效應(yīng)最強(qiáng)的shRCAS1。使用最終確定的shRCAS1及構(gòu)建成功的RCAS1高表達(dá)質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RCAS1高、低表達(dá)細(xì)胞系,24-48h后應(yīng)用muse儀檢測(cè)RCAS1-high及shRCAS1對(duì)于Pca細(xì)胞凋亡、周期方面的改變;使用MTT法檢測(cè)RCAS1-high及shRCAS1對(duì)于Pca細(xì)胞增殖能力的改變;應(yīng)用transwell法測(cè)定RCAS1-high及shRCAS1對(duì)于Pca細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果:1、在PC3細(xì)胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表達(dá)量最低;LNCaP細(xì)胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表達(dá)量最高,C42中RCAS1 mRNA及蛋白表達(dá)量與LNCaP相差不大;2、分別于LNCaP、C42細(xì)胞系轉(zhuǎn)染shRCAS1-406、、shRCAS1-561、shRCAS1-598、shRCAS1-690、shRCAS1-NC、shGAPDH,通過qPCR及Western Blot技術(shù)篩選出RCAS1抑制作用最強(qiáng)的質(zhì)粒為shRCAS1-406;3、以pFLAG-CMV為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建RCAS1高表達(dá)質(zhì)粒RCAS1-high,通過雙酶切及基因測(cè)序鑒定插入片段大小正確、序列無突變,轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞48h后應(yīng)用qPCR及Western Blot半定量RCAS1豐度,實(shí)驗(yàn)證實(shí)RCAS1 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著升高,RCAS1高表達(dá)質(zhì)粒RCAS1-high構(gòu)建成功;4、轉(zhuǎn)染RCAS1-high 48h后,PC3增殖能力相比Vector組明顯提高,凋亡率相比Vector組明顯下降,RCAS1表達(dá)增高可促進(jìn)PC3由G0/G1期轉(zhuǎn)進(jìn)S期,transwell實(shí)驗(yàn)顯示PC3侵襲性增強(qiáng);LNCaP、C42細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRCAS1-406后,發(fā)現(xiàn)RCAS1表達(dá)降低可顯著抑制細(xì)胞增殖能力,LNCaP、C42凋亡增加,且G0/G1期比例相比Vector組增加,侵襲性減弱;結(jié)論:1、RCAS1在PC3中含量最低,在LNCaP、C42中含量最高;2、成功篩選出RCAS1抑制作用最強(qiáng)的質(zhì)粒為shRCAS1-406;3、成功構(gòu)建RCAS1高表達(dá)質(zhì)粒RCAS1-high;4、RCAS1高表達(dá)可顯著增加PC3細(xì)胞增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞侵襲,顯著抑制細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化;而RCAS1低表達(dá)可顯著降低LNCaP、C42增殖,阻礙細(xì)胞侵襲,顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并促使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果結(jié)果2.1 RCAS1/EBAG9 高、低表達(dá)細(xì)胞系的確立培養(yǎng) PC3、LNCap、C4-2、DU145 等四種前列腺癌細(xì)胞系，應(yīng)用 qPCR 及western blot 等方法檢測(cè)各細(xì)胞系中 RCAS1/EBAG9 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PC3細(xì)胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達(dá)量最低，LNCap、C4-2 細(xì)胞系中RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達(dá)量最高（如圖 1）。因此，選擇 PC3 細(xì)胞系進(jìn)行 RCAS1/EBAG9 高表 達(dá) 實(shí) 驗(yàn) 研究 ， 選擇 LNCap 、 C4-2 細(xì) 胞 系 進(jìn) 行RCAS1/EBAG9 低表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究。

shRCAS1-690GATGCACCCACCAGTGTAAAGTTCAAGAGACTTTACACTGGTGGGTGCATCTTGGACATGACACCAACTATTAGTTCAAGAGACTAATAGTTGGTGTCATGTCCTT因 LNCap、C4-2 細(xì)胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達(dá)量最高，本實(shí)驗(yàn)選擇 LNCap、C4-2 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染 shRCAS1 質(zhì)粒套餐，，其中 C4-2 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染shRCAS1 質(zhì)粒套餐后熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)用 Image J 軟件融合圖像后如圖 2 。shRCAS1-NC shGAPDH shRCAS1-406
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2586304