【摘要】：目的:脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(CD36)在長(zhǎng)鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝性炎癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色。許多的研究證實(shí)腎臟的多種病變都伴隨著其組織細(xì)胞中CD36的表達(dá)的升高。近年來(lái),糖尿病腎病的患病率逐漸增高,學(xué)者們對(duì)于其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了研究,結(jié)果提示近端腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和變性與CD36的表達(dá)息息相關(guān)。棕櫚�；堑鞍追g后修飾中的一種,本文研究的CD36也可以被棕櫚�；揎�,我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CD36的棕櫚�；揎棶惓Ｔ黾涌梢源龠M(jìn)肝、脂肪等組織的炎癥、脂質(zhì)異常的積聚、細(xì)胞的凋亡等損害,但是是否與腎臟疾病相關(guān)卻罕有報(bào)道。因此,本研究擬在探討CD36的棕櫚酰化修飾與腎臟疾病的關(guān)系及其分子機(jī)制的研究。方法:第一部分:選取C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)分組,分別通過(guò)尾靜脈注射3種不同的慢病毒,第一組為空病毒(NC),第二組為野生型過(guò)表達(dá)CD36的病毒(WTOE),第三組為CD36四個(gè)棕櫚酰化修飾位點(diǎn)突變的病毒(AASS)。上述實(shí)驗(yàn)小鼠都給予高脂飲食(High fat diet,HFD)喂養(yǎng)兩個(gè)月。收集小鼠的24h尿量,血清和腎臟組織,檢測(cè)小鼠尿液中β2微球蛋白(β2-microglobulin,Β2-MG)、24h尿蛋白(urinary albumin,24h UPRO),用CD36免疫組化和Western Blot的方法檢測(cè)了小鼠腎組織CD36的表達(dá),腎組織CD36的棕櫚酰化修飾水平的情況采用�；�-生物素置換的方式來(lái)評(píng)估。HE染色被應(yīng)用來(lái)觀察腎組織形態(tài)學(xué),F4/80免疫組化用來(lái)觀察腎組織炎癥浸潤(rùn)情況,RT-PCR被用來(lái)檢測(cè)小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、天狼星紅染色、TGF-β和α-SMA免疫組化檢測(cè)小鼠腎臟組織纖維化情況。第二部分:HK2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染3種不同的慢病毒,第一種為空病毒(NC),第二種為野生型過(guò)表達(dá)CD36的病毒(WTOE),第三種為CD36四個(gè)棕櫚酰化修飾位點(diǎn)突變的病毒(AASS)。利用一定濃度的嘌呤霉素篩選細(xì)胞一段時(shí)間后,存活的細(xì)胞即為穩(wěn)定細(xì)胞系。HK2細(xì)胞及其相關(guān)的穩(wěn)定細(xì)胞系(人腎小管上皮細(xì)胞)及HMC細(xì)胞(人腎臟系膜細(xì)胞)給予棕櫚酸(Palmitate acid,PA)處理,ABE法被用來(lái)評(píng)估體外模型中CD36的棕櫚�；揎椝�,用Western blot檢測(cè)Jun N-terminal kinase(JNK)的磷酸化及NF-κB的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子、趨化因子、纖維化因子的表達(dá)。第三部分:本文中脂筏的提取采用去垢劑抵抗(DRMs)的方式。超速離心分離出脂筏結(jié)構(gòu)后,Western Blot被用來(lái)檢測(cè)HK2穩(wěn)定細(xì)胞系中CD36在脂筏中的分布,選取棕櫚酸(0.16mmol/L PA)或協(xié)同加用棕櫚酰化抑制劑2-BP處理HMC細(xì)胞后,檢測(cè)了上述細(xì)胞中CD36在脂筏中的分布。選取免疫共沉淀法評(píng)價(jià)體內(nèi)外模型中二聚體(TLR4/CD36)的結(jié)合情況。結(jié)果:第一部分:在WTOE組小鼠中,腎臟CD36的棕櫚酰化水平增高,尿量增加,尿β2微球蛋白和24h尿蛋白含量明顯增多,與NC組的相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05;HE和天狼星紅染色,F4/80,TGF-β及α-SMA免疫組化結(jié)果和RT-PCR結(jié)果顯示:WTOE組小鼠腎臟組織與NC組小鼠比較,有炎癥浸潤(rùn),纖維化程度明顯(p0.05);而AASS組小鼠與WTOE組小鼠相比,腎臟CD36的棕櫚酰化水平降低,尿量減少,尿β2微球蛋白和24h尿蛋白含量明顯減少,腎組織炎癥浸潤(rùn)和纖維化程度也是減輕的(p0.05)。第二部分:體外實(shí)驗(yàn)中,WTOE組細(xì)胞CD36的棕櫚�；揎椝捷^NC組增加,AASS組細(xì)胞CD36的棕櫚�；揎椝奖萕TOE組的降低。采用突變或抑制劑處理皆可以降低修飾水平,WTOE組細(xì)胞JNK的磷酸化水平和NF-κB均較NC組增高,炎癥因子、趨化因子及纖維化因子均較NC組表達(dá)高(P0.05);而AASS組細(xì)胞JNK的磷酸化信號(hào)水平和NF-κB激活情況均較WTOE組降低,炎癥因子、趨化因子及纖維化因子也比WTOE組細(xì)胞表達(dá)降低(p0.05)。第三部分:體外試驗(yàn)中Western blot脂筏的結(jié)果顯示,WTOE組細(xì)胞中CD36在脂筏結(jié)構(gòu)的分布比例多于NC組中CD36在脂筏結(jié)構(gòu)中的分布比例,而采用突變(AASS)或者抑制劑(2BP)處理均可降低CD36在脂筏結(jié)構(gòu)中的分布。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,WTOE組細(xì)胞中CD36和TLR4形成共聚體比NC組增多,而采用突變(AASS)或者抑制劑(2BP)處理后均可降低CD36與TLR4形成共聚體(P0.05)。結(jié)論:CD36過(guò)表達(dá)后,棕櫚酰化修飾程度增加,小鼠腎臟炎癥浸潤(rùn)加重,纖維化程度加重。而采用抑制劑或突變的方法干預(yù)CD36的棕櫚酰化可以減少CD36在脂筏里的定位,影響與TLR4形成共聚體,減少JNK的磷酸化,降低NF-κB的激活,降低體內(nèi)外炎癥水平,減輕腎損傷。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Hadja Fatima Tbahriti;Djamel Meknassi;Rachid Moussaoui;Amar Messaoudi;Lakhdar Zemour;Abbou Kaddous;Malika Bouchenak;Khedidja Mekki;;Inflammatory status in chronic renal failure: The role of homocysteinemia and pro-inflammatory cytokines[J];World Journal of Nephrology;2013年02期

，

本文編號(hào)：2573818