【摘要】：目的:對于非肌層浸潤性膀胱癌,不論是術后免疫治療還是局部化療,其高復發(fā)率和高進展率依然是泌尿外科領域難以解決的問題,且大多藥物毒副作用十分明顯,使患者承受著巨大的痛苦。如患者條件允許,符合手術適應癥,肌層浸潤性膀胱癌患者多數(shù)會選擇根治性膀胱切除術,術后予以輔助性全身化療,現(xiàn)應用于膀胱癌全身化療的藥物主要是鉑類為主的化療藥物,然而,此類化療藥物因其副作用明顯,耐藥性等問題威脅著臨床中肌層浸潤性膀胱癌的治療。因此,能夠尋找出一種毒副作用小,作用效果明顯且不易產(chǎn)生耐藥或者能夠逆轉耐藥的的藥物已迫在眉睫。和厚樸酚是傳統(tǒng)中藥厚樸的提取物,在體內及體外實驗均證實其具有良好的抗腫瘤作用,且毒副作用很低,其在膀胱癌中研究也有報道,但研究尚淺。本研究用不同濃度的和厚樸酚處理膀胱癌細胞(T24及EJ),觀察和厚樸酚對膀胱癌細胞的增殖抑制情況,促進凋亡及抑制血管生成等生物學行為的影響,并嘗試探討和厚樸酚抗膀胱癌的作用機理。方法:體外培養(yǎng)對數(shù)生長期的膀胱癌T24和EJ細胞,并用不同濃度的和厚樸酚進行處理。首先用肉眼觀察不同處理組的腫瘤細胞的數(shù)量變化,確認有效果后進行后續(xù)試驗。MTT和單克隆形成試驗觀察細胞的增殖情況,同時用MTT法篩選出藥物的最佳處理濃度。用流式細胞術檢查和厚樸酚對T24,EJ細胞周期和凋亡的影響,用PCR篩選周期,凋亡,增殖及血管生成等相關蛋白的mRNA的表達水平,腫瘤細胞的增殖,凋亡,周期蛋白的表達情況采用Western blot實驗及Caspase相關試劑盒檢驗并推測和厚樸酚抗膀胱癌可能的相關通路。結果:1、MTT結果:和厚樸酚處理膀胱癌細胞T24和EJ細胞后,兩種腫瘤細胞均呈現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象,且這種現(xiàn)象呈現(xiàn)時間劑量依賴性。單克隆形成試驗表明,和厚樸酚對膀胱癌T24細胞單克隆的形成具有明顯的抑制作用,且此作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。2、流式細胞術結果:用不同濃度的和厚樸酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)處理膀胱癌T24和EJ細胞48h后,我們發(fā)現(xiàn)隨著和厚樸酚濃度的增高,兩種腫瘤細胞的周期抑制效果越明顯,并且T24和EJ細胞大多被抑制在G1期向S期轉化(即抑制腫瘤細胞的有絲分裂)。同樣方法處理上述腫瘤細胞后,隨著和厚樸酚濃度的增高,兩種細胞的凋亡細胞所占比例逐漸升高,且呈現(xiàn)劑量依賴效應。3、PCR檢測結果:搜集不同濃度和厚樸酚處理細胞的總RNA并將其反轉錄成cDNA后檢測周期,凋亡,增殖,血管生成等相關基因在mRNA水平的變化情況,顯示和厚樸酚作用后的腫瘤細胞中PCNA,CDK-4,CDK-6,BCL-2,MCL-1,VEGF的mRNA水平明顯下降;Bad,Bax,Bak的mRNA表達量明顯上升。以上結果顯示,和厚樸酚能夠明顯抑制膀胱癌T24和EJ細胞的增殖作用(周期抑制),誘導T24和EJ細胞的凋亡,和抑制腫瘤血管的生成。4、Caspase-3、8、9檢測結果:用不同濃度的和厚樸酚(0ul,20ul,40 ul,60 ul)處理膀胱癌T24和EJ細胞,發(fā)現(xiàn)隨著和厚樸酚藥物濃度的增加,Caspase-3、8、9的表達量逐漸增加,這種濃度增加的現(xiàn)象呈現(xiàn)出時間劑量依賴效應,表明和厚樸酚誘導膀胱癌T24和EJ細胞的凋亡。并且這種凋亡呈現(xiàn)出Caspase依賴的途徑。5、Western-blot結果顯示:和厚樸酚能夠抑制CDK-4,CDK-6,BCL-2蛋白的表達,能夠增強Bax蛋白的表達,且呈現(xiàn)劑量依賴關系,進一步驗證上述結果。結論:和厚樸酚能夠抑制膀胱癌T24及EJ細胞的增殖,其抑制增殖的主要機理是腫瘤細胞大多被抑制在G1/S期的節(jié)點上,表明和厚樸酚能夠阻止腫瘤細胞G1期向S期轉化,抑制腫瘤細胞的有絲分裂;和厚樸酚能夠通過誘導Caspase依賴途徑和Caspase非依賴途徑導致膀胱癌細胞T24及EJ細胞的凋亡。在者,和厚樸酚不僅通過內源性途徑影響膀胱癌T24及EJ細胞的凋亡,還通過外源性途徑影響腫瘤細胞的凋亡;和厚樸酚能夠抑制膀胱癌T24及EJ細胞的血管的生成�？傊�,和厚樸酚具有良好的抗膀胱癌腫瘤細胞的效果,其能夠從多種方面抑制膀胱癌腫瘤細胞,但仍需深入的去探討相關的通路以期為臨床的應用提供更加充分的理論依據(jù)。
【圖文】：

結果2.1 MTT 法檢測不同濃度（0uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 和 EJ 細胞后細胞的增殖情況2.1.1 應用不同濃度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkiol 作癌 T24 細胞 24、48、72h 后，經(jīng)酶標儀測出各組的 OD 值，利用公式活力，結果顯示各組的細胞活力表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），表明 H膀胱癌 T24 細胞的增殖具有明顯的抑制作用，這種增殖的抑制效果與量正相關（如圖 2.1，，表 2.1）。

2.1.2 應用不同濃度（0 uM、20uM、40uM、60uM）的 Honkio癌 EJ 細胞 24、48、72h 后，經(jīng)酶標儀測出各組的 OD 值，利用公式力，結果顯示各組的細胞活力表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），表明 胱癌 EJ 細胞的增殖具有明顯的抑制作用，這種增殖的抑制效果與時相關（如圖 2.2，表 2.2）。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

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本文編號：2572576