【摘要】：目的：對超聲輻照模式、超聲聲強、輻照時間、微泡濃度參數(shù)進行優(yōu)化，確定超聲聯(lián)合聲諾維微泡誘導(dǎo)人前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的最佳治療參數(shù)，觀察超聲聯(lián)合聲諾維對DU145細(xì)胞生長的影響、探討其機制；建立人前列腺癌DU145裸鼠皮下移植瘤模型，觀察超聲聯(lián)合聲諾維對移植瘤生長及小窩蛋白-1(caveolin-1)表達的影響。 方法：（1）用脈沖波和連續(xù)波兩種不同模式的低頻超聲輻照DUl45細(xì)胞懸液，輻照后用熒光顯微鏡檢測FD500染色陽性率反映細(xì)胞膜通透性改變情況；用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。 （2）應(yīng)用正交設(shè)計的方法，選定超聲聲強、輻照時間、微泡濃度三因素，每因素設(shè)定三水平。超聲聲強：0.15W/cm2，0.30W/cm2和0.45W/cm2。輻照時間：10s，20s和30s。微泡濃度：10％，20％和50％。按照正交設(shè)計表進行輻照，輻照后24h用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，確定最佳治療參數(shù)。 （3）利用優(yōu)化的超聲治療參數(shù)，輻照前列腺癌DU145細(xì)胞懸液。實驗分為6組：對照組、聲諾維組、超聲組、超聲聯(lián)合聲諾維組、甲基-β-環(huán)糊精組和膽固醇組。甲基-β-環(huán)糊精組細(xì)胞在超聲輻照前24h提前向培養(yǎng)瓶中加入甲基-β-環(huán)糊精進行干預(yù)。膽固醇組細(xì)胞經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精干預(yù)24h后用冷磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入RPMI-1640培養(yǎng)基和膽固醇繼續(xù)培養(yǎng)24h。用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western-blot檢測小窩蛋白-1、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（磷酸化Akt）和血管內(nèi)皮生長因子的表達情況。 （4）建立人前列腺癌DU145裸鼠皮下移植瘤模型，將32只荷瘤裸鼠隨機分成4組：對照組、聲諾維組、超聲組、超聲聯(lián)合聲諾維組。以頻率80kHz，聲強0.5W/cm2超聲進行輻照，連續(xù)3周觀察腫瘤生長情況，繪制生長曲線，用Western-blot和免疫組織化學(xué)的方法檢測各組瘤組織小窩蛋白-1表達，用ELISA法檢測血清小窩蛋白-1表達情況。 結(jié)果：（1）與對照組相比，兩種模式的超聲波處理組FD500染色陽性率均增加；與連續(xù)波模式相比，脈沖波模式FD500染色陽性率增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。脈沖波模式輕微抑制細(xì)胞增殖，連續(xù)波能明顯抑制細(xì)胞增殖(PO.05)。與對照組相比，兩種模式的超聲波處理組DUl45細(xì)胞凋亡率均增加；與脈沖波模式相比，連續(xù)波模式DUl45細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 （2）對細(xì)胞凋亡的影響因素，超聲聲強輻照時間微泡濃度。各因素水平影響：超聲聲強：0.45W/cm20.30W/cm20.15W/cm2；輻照時間：30s20s10s；微泡濃度：20％50％10％。 （3）細(xì)胞生長曲線顯示，對照組和聲諾維組細(xì)胞生長迅速，而超聲組以及超聲聯(lián)合聲諾維組細(xì)胞生長相對緩慢。培養(yǎng)48h后，與對照組相比，超聲組以及超聲聯(lián)合聲諾維組明顯抑制細(xì)胞生長，以超聲聯(lián)合聲諾維組抑制作用最明顯，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。與超聲聯(lián)合聲諾維組相比，甲基-β-環(huán)糊精組抑制了DU145細(xì)胞的生長，細(xì)胞生長速度緩慢，而膽固醇組能部分逆轉(zhuǎn)甲基-β-環(huán)糊精組抑制細(xì)胞生長的作用。流式檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，超聲組以及超聲聯(lián)合聲諾維組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。而且，與超聲組相比，超聲聯(lián)合聲諾維組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。與超聲聯(lián)合聲諾維組相比，甲基-β-環(huán)糊精組明顯促進DU145細(xì)胞凋亡，兩組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。而膽固醇組能部分逆轉(zhuǎn)甲基-β-環(huán)糊精組促進細(xì)胞凋亡的作用。Western-blot結(jié)果顯示，超聲組小窩蛋白-1、磷酸化Akt和血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達輕微下調(diào)，而超聲聯(lián)合聲諾維組小窩蛋白-1、磷酸化Akt和血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達明顯減少，與對照組相比，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。與超聲聯(lián)合聲諾維組相比，甲基-β-環(huán)糊精組小窩蛋白-1、磷酸化Akt和血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達均明顯下調(diào)，組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。而膽固醇組能輕微上調(diào)甲基-β-環(huán)糊精組小窩蛋白-1、磷酸化Akt和血管內(nèi)皮生長因子蛋白的表達。 （4）與對照組和聲諾維組相比，超聲組移植瘤體積和瘤體重量降低；與其他各組相比，超聲聯(lián)合聲諾維組明顯抑制移植瘤生長，移植瘤體積和瘤體重量降低更明顯，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（PO.05）。用Western-blot和免疫組織化學(xué)法檢測均顯示，與對照組相比，超聲組小窩蛋白-1表達明顯降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（PO.05）；超聲聯(lián)合聲諾維組小窩蛋白-1表達降低更明顯，差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（PO.01）。超聲組輕微降低血清小窩蛋白濃度，與對照組相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(PO.05)；超聲聯(lián)合聲諾維組血清小窩蛋白-1濃度明顯降低，與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（PO.05），而且血清小窩蛋白-1濃度的變化與瘤體重量的變化存在一定的相關(guān)性。 結(jié)論：（1）不同輻照模式的低頻超聲能夠影響前列腺癌DUl45細(xì)胞的生物學(xué)行為。應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染或者載藥目的時，選擇脈沖波模式可以增加細(xì)胞膜通透性；應(yīng)用于治療目的時，選擇連續(xù)波模式可以抑制腫瘤生長。 （2）低頻超聲聯(lián)合聲諾維可誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡。使用正交設(shè)計方法確定最優(yōu)超聲參數(shù)組合，超聲聲強：0.45W/cm2，輻照時間：30s，微泡濃度：20％。 （3）低頻超聲聯(lián)合聲諾維能夠抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖，其機制可能與干擾了小窩蛋白-1、磷酸化Akt以及血管內(nèi)皮生長因子信號通路有關(guān)。 （4）低頻超聲聯(lián)合聲諾維能夠抑制前列腺癌DU145荷瘤裸鼠生長，，這種抑制作用可能與下調(diào)的小窩蛋白-1有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25;R454.3

【參考文獻】

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本文編號：2557268