發(fā)布時(shí)間：2019-10-02 00:27

【摘要】：背景和目的：IgA腎�。↖gAnephrophathy, IgAN）是我國(guó)最常見(jiàn)的慢性腎臟病，也是導(dǎo)致我國(guó)終末期腎臟疾�。蚨景Y）的最主要病因。多數(shù)IgAN是進(jìn)展性疾病，因此，臨床上需要能及時(shí)反映IgAN病情變化的生物標(biāo)志物用以診斷、評(píng)估病情、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。尿沉渣miRNA是2010年以來(lái)尋找IgAN標(biāo)志物新的方向，國(guó)內(nèi)外也有學(xué)者開(kāi)展了有益的嘗試，發(fā)現(xiàn)某些miRNAs與IgAN的臨床病理和預(yù)后有一定相關(guān)。但由于是單中心、小樣本研究，對(duì)IgAN疾病特征反映并不全面。本課題第一次利用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，高通量篩選IgAN新的miRNA分子標(biāo)志物，進(jìn)而通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證，篩選出幾種IgAN特異性的miRNA標(biāo)志物，評(píng)估其對(duì)IgAN診斷及病情判斷中的作用。進(jìn)一步明確上述miRNAs標(biāo)志物在尿沉渣中的具體細(xì)胞來(lái)源及其可能的作用，為IgAN無(wú)創(chuàng)診斷研究奠定基礎(chǔ)。 方法：收集中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科2012年11月至2014年1月首次經(jīng)腎活檢證實(shí)的IgAN患者。正常對(duì)照組為年齡性別匹配的健康人。疾病對(duì)照組為首次經(jīng)腎活檢證實(shí)的非IgAN原發(fā)性腎小球疾病患者。在腎活檢前留取尿液標(biāo)本，通過(guò)離心分離尿沉渣和尿液上清。腎臟病理采用Lee氏分級(jí)和半定量評(píng)分。1、尿沉渣miRNA芯片檢測(cè)：提取尿沉渣總RNA，利用安捷倫公司miRNA芯片V19.0對(duì)9個(gè)IgAN患者（3個(gè)LEE氏II級(jí)，3個(gè)III級(jí)和3個(gè)IV-V級(jí)）和3個(gè)正常人進(jìn)行差異miRNAs篩選。并與文獻(xiàn)報(bào)道的IgAN腎組織和外周血白細(xì)胞的miRNAs芯片結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，明確三組不同樣本來(lái)源miRNAs表達(dá)趨勢(shì)的異同。2、尿沉渣miRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證與臨床病理相關(guān)分析：利用SYBR Green熒光定量PCR，擴(kuò)大樣本人群，檢測(cè)尿沉渣miRNAs在84個(gè)IgAN患者、29個(gè)正常人和21個(gè)疾病對(duì)照組患者中的表達(dá)差異。繪制ROC曲線（receiver operating characteristic curve，受試者作業(yè)特征曲線）評(píng)估幾種標(biāo)志物診斷IgAN的敏感度和特異度。并分析其與IgAN臨床、病理指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系。3、利用磁珠分離尿紅細(xì)胞和尿上清液微泡提取等技術(shù)，確定miRNAs標(biāo)志物的具體細(xì)胞來(lái)源，并分析其可能的生物學(xué)作用。 結(jié)果：1.利用高通量miRNAs芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出IgAN組和正常對(duì)照組尿沉渣差異表達(dá)的miRNAs共214個(gè)。此外還發(fā)現(xiàn)有92個(gè)miRNAs在IgAN不同病理分級(jí)間（LEE氏II級(jí)，III級(jí)和IV-V級(jí)）有表達(dá)差異。通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的IgAN腎組織和外周血白細(xì)胞的miRNAs芯片結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)三種樣本來(lái)源miRNAs的表達(dá)趨勢(shì)異同。尿沉渣與腎組織miRNAs芯片結(jié)果相比，有54.55%的miRNAs趨勢(shì)一致，33.78%趨勢(shì)相反。與外周血白細(xì)胞芯片結(jié)果對(duì)比，有48.65%的miRNAs趨勢(shì)相同，2個(gè)miRNAs趨勢(shì)相反。匯總?cè)齻�(gè)芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-98，miR-148b，let-7d，miR-374b，miR-17和miR-502-3p在三個(gè)miRNA芯片結(jié)果中都有顯著差異。 2. IgAN組的尿沉渣miR-25、miR-144、miR-486表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組和疾病對(duì)照組，而IgAN組miR-135a和miR-150表達(dá)水平則顯著低于正常對(duì)照組。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486是IgAN的特異性生物標(biāo)志物，其聯(lián)合診斷IgAN的特異性達(dá)100%，敏感性為89.9%。此外，IgAN組miR-144、miR-486和miR-150在不同Lee氏分級(jí)的亞組中，表達(dá)量有顯著差異，miR-144和miR-486在Lee氏III級(jí)中表達(dá)量最高，而miR-150則在Lee氏IV-V級(jí)中表達(dá)水平最高。miR-150與全球硬化呈正相關(guān)。而miR-144、miR-135a、miR-150與節(jié)段硬化呈正相關(guān)。MiR-486與新月體呈負(fù)相關(guān)，而miR-135a則與新月體呈正相關(guān)。有腎血管病變組miR-486的表達(dá)量顯著高于無(wú)血管病變組。間質(zhì)纖維化輕度、中度、重度的3組間miR-150的表達(dá)量有顯著差異，重度纖維化組表達(dá)量顯著高于輕度組和中度組。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-135a、miR-25和miR-486與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層有密切關(guān)系。在臨床指標(biāo)中，miR-25、miR-144、miR-486、miR-150與Cys呈正相關(guān)。MiR-486、miR-150與Scr呈正相關(guān)，且miR-486與eGFR呈負(fù)相關(guān)。 3.本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-25、miR-144和miR-486在尿紅細(xì)胞滿視野組的表達(dá)量顯著高于非滿視野組。利用磁珠分離尿紅細(xì)胞技術(shù)將紅細(xì)胞分離提純（紅細(xì)胞組）發(fā)現(xiàn)上述miRNAs表達(dá)量大大升高，而不含紅細(xì)胞組上述miRNAs表達(dá)量則顯著降低。正常人中上述miRNAs表達(dá)水平很低，在加入自身血紅細(xì)胞后尿沉渣上述miRNAs表達(dá)顯著增加。體外分離尿沉渣中含有的主要細(xì)胞成分，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞，檢測(cè)miR-25、miR-144和miR-486的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞中miRNAs的基線水平也顯著高于其他細(xì)胞。 4、IgAN組和正常對(duì)照組的血紅細(xì)胞miR-144和miR-486的表達(dá)量無(wú)顯著差異，而IgAN組miR-25的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組。向IgAN患者尿上清液中加入患者自身血紅細(xì)胞，制造外科性血尿模型，發(fā)現(xiàn)IgAN尿紅細(xì)胞miR-25、miR-144和miR-486的表達(dá)量顯著高于外科性血尿模型組。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，IgAN組尿上清液微泡中miR-144和miR-486表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，且微泡中miR-486相對(duì)表達(dá)量很高。 5、本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，miR-25和miR-486這兩個(gè)紅細(xì)胞來(lái)源的miRNAs與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層密切相關(guān)，有節(jié)段增厚和分層組miR-25和miR-486的表達(dá)量顯著升高。本研究納入的IgAN患者中，有71.43%存在包曼囊壁節(jié)段增厚和分層，顯著高于疾病對(duì)照組的9.52%。這與尿沉渣中IgAN組miR-25和miR-486表達(dá)量顯著高于疾病對(duì)照組一致。IgAN尿紅細(xì)胞滿視野伴尿蛋白陽(yáng)性者包曼囊彌漫性增厚組的腎小球比例為72.34%，高于尿紅細(xì)胞非滿視野伴尿蛋白陽(yáng)性組的54.5%。 結(jié)論：本研究采用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析了IgAN尿沉渣miRNAs表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)與來(lái)源于腎組織及外周血白細(xì)胞表達(dá)譜的異同。進(jìn)而篩選出可用于無(wú)創(chuàng)診斷IgAN的miRNAs，不僅具有病疾病診斷特異性，而且與臨床、病理指標(biāo)有良好相關(guān)性。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486主要來(lái)源于尿中紅細(xì)胞，與包曼囊壁增厚和分層密切相關(guān)。尿紅細(xì)胞miRNA可能通過(guò)微泡釋放，發(fā)揮生物學(xué)作用，參與IgAN的病理生理改變。其具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
【圖文】：

16圖 1-1. 正常對(duì)照組（左側(cè)）與 IgAN 輕度組（右側(cè)）間尿沉渣 miRNA 表達(dá)譜的差異（共發(fā)現(xiàn) 189 個(gè)差異表達(dá)的 miRNAs，列出的是 p＜0.01 的指標(biāo)）。

17圖 1-2. 正常對(duì)照組（左側(cè)）與 IgAN 硬化組（右側(cè)）間尿沉渣 miRNA 表達(dá)譜的差異（共發(fā)現(xiàn) 23 個(gè)差異表達(dá)的 miRNAs，列出的是 p＜0.01 的指標(biāo)）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692.31

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本文編號(hào)：2544658