【摘要】：目的： 膀胱興奮性異常是最常見的膀胱功能障礙之一，神經(jīng)病變、部分膀胱出口梗阻(PBOO)、炎癥和其它因素最終會導(dǎo)致膀胱的興奮性變化，臨床上可引起尿頻、尿急、尿失禁、懶膀胱等癥狀，甚至還將導(dǎo)致腎或輸尿管積水以及腎臟的功能損害[1]。逼尿肌不穩(wěn)定(DI)為膀胱在儲尿期發(fā)生的自發(fā)非排尿性的收縮，是常見的膀胱興奮性異常。目前，導(dǎo)致膀胱興奮性異常的病因還沒有被完全闡明，對DI的發(fā)病機制也還存在較大爭議，“神經(jīng)源性學(xué)說”和“肌源性學(xué)說”都能一定程度解釋膀胱興奮性異常的機制，前者認(rèn)為膀胱興奮性由中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)控制，而后者認(rèn)為膀胱逼尿肌興奮性的改變能夠主動參與膀胱功能的調(diào)節(jié)。臨床上針對興奮性異常的治療主要采取神經(jīng)受體活性藥物，但治療效果并不明顯，因此，肌源性因素日益受到重視。 目前越來越多的證據(jù)證明膀胱存在著類似在胃、腸道中的起搏樣卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(ICCs)，猶如在胃腸道中的功用，膀胱ICC細(xì)胞很可能也具有起搏功能，并通過細(xì)胞間連接將信號向平滑肌傳播，，對膀胱的興奮性起源和調(diào)節(jié)以及信號的傳遞發(fā)揮重要的樞紐功能。 ICC細(xì)胞上各種離子通道對細(xì)胞功能的發(fā)揮具有重要作用，目前在ICC細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的通道有超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子(HCN)通道、T型鈣通道、鈉鈣交換體、ATP依賴的鉀通道等，大電導(dǎo)鈣激活鉀(BK)通道在膀胱ICC細(xì)胞中的作用還沒有得到充分的認(rèn)識。BK通道由細(xì)胞膜去極化或鈣離子內(nèi)流激活，通過使動作電位復(fù)極化，反饋性的抑制細(xì)胞的興奮，然而BK通道是否在ICC細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能還缺乏深入的探索，研究膀胱ICC細(xì)胞上BK通道可為膀胱興奮性異常的基礎(chǔ)研究提供新的方向。 本課題通過分子生物和細(xì)胞形態(tài)學(xué)等技術(shù)方法對BK通道以及亞型在膀胱ICC細(xì)胞中的表達及分布進行了觀察，對膀胱ICC細(xì)胞上BK通道的電活動生理特性進行了初步觀測，并利用功能學(xué)方法對BK通道參與ICC細(xì)胞興奮性調(diào)控的機制進行了初步研究。 構(gòu)建方法： 1.采用2-3月齡大鼠為研究對象，對模型組實施PBOO手術(shù)導(dǎo)致DI，與正常大鼠進行對比研究。 2. Western blotting檢測大鼠膀胱BK通道亞型的表達。 3.免疫熒光雙染實驗觀測BK通道亞型在膀胱ICC細(xì)胞中的分布，對比DI與正常膀胱ICC細(xì)胞BK通道表達變化。 4.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對急性分離的正常及DI大鼠膀胱ICC細(xì)胞上的BK通道外向電流進行觀測，并記錄阻斷劑IBTX加入后電流的改變以及區(qū)別。 5.單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)對膜片鉗電極鉗取的ICC細(xì)胞進行鑒定。 6.激光共聚焦顯微鏡記錄培養(yǎng)的正常及DI大鼠膀胱ICC細(xì)胞胞內(nèi)的鈣離子濃度在BK通道阻斷劑作用下的變化，比較兩組間變換的區(qū)別，以此了解BK通道在ICC細(xì)胞興奮性中的功用。 結(jié)果： 1.大部分行部分膀胱出口梗阻手術(shù)后的大鼠表現(xiàn)出DI癥狀，可用作研究模型。 2. WB檢測到大鼠膀胱中BK通道蛋白表達，免疫熒光染色觀測到正常及DI大鼠膀胱組織片c-kit陽性的細(xì)胞同時表達BK免疫反應(yīng)陽性。并且通過熒光像素值進行比較分析發(fā)現(xiàn)DI膀胱ICC細(xì)胞中BK通道表達較少。 3.成功獲得急性分離大鼠膀胱ICC細(xì)胞，記錄到典型的BK外向電流，BK通道阻斷劑IBTX作用后能顯著降低該電流強度，通過對比發(fā)現(xiàn)DI大鼠膀胱ICC細(xì)胞BK電流強度低于正常。 4. IBTX能使靜息狀態(tài)下膀胱ICC細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度升高。然而DI大鼠膀胱ICC細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度升高的幅度小于正常。 5.成功對檢測細(xì)胞進行了單細(xì)胞RT-PCR，證明記錄數(shù)據(jù)的細(xì)胞表達C-KIT而不表達Myosin。 結(jié)論： 大鼠膀胱ICC細(xì)胞存在BK通道，亞型以α、β1、β2、β3、β4為主。 BK通道參與了使動作電位復(fù)極化并穩(wěn)定膀胱ICC細(xì)胞膜電位的作用。 抑制BK通道會增高胞內(nèi)的鈣離子濃度，BK通道功能與膀胱上ICC細(xì)胞的興奮性緊密相關(guān)。 BK通道對膀胱ICC細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用與DI的發(fā)生密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R694.5

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本文編號：2527839