【摘要】：腎小管間質纖維化以腎小管萎縮、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)積聚和腎間質慢性炎細胞浸潤纖維化為特征,是各種原因導致的慢性腎臟病的共同病理生理過程。其發(fā)生發(fā)展包括多個環(huán)節(jié),如：抑制與促進纖維化細胞因子失衡、氧化應激反應增強、炎癥反應、腎臟固有細胞及免疫細胞凋亡等。腎小管間質纖維化程度與腎功能進行性下降相關,并且與疾病的預后密切相關。在此過程中,腎臟組織呈不可逆的損傷,并伴隨腎臟功能的逐漸下降,逐步發(fā)展至終末期腎病。 腎小管上皮細胞轉分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是導致腎小管間質纖維化的重要因素。腎小管上皮細胞是一種極性細胞,其極性主要是由表皮黏附分子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等細胞間緊密連接成分以及細胞與基底膜的粘附作用來維持的。多種修飾后蛋白,如脂質過氧化產物、晚期糖基化產物(advanced glycation end products, AGES)等可激活腎小管上皮細胞,增加TGF-β等致纖維化生長因的表達,誘導ECM大量合成、分泌,導致腎間質纖維化。2002年,Iwano等學者成功建立單側輸尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction, UUO)小鼠模型,該小鼠腎小管上皮細胞能特異性表達LacZ,通過LacZ基因表達示蹤細胞的來源,發(fā)現(xiàn)約36%的間質成纖維細胞由被激活的腎小管上皮細胞EMT而成,轉分化后的腎小管上皮細胞獲得分泌ECM的功能,合成、分泌ECM增多,但降解減少,ECM數(shù)量明顯增多,最終導致腎間質纖維化。腎小管上皮細胞EMT的基本步驟包括：分化成熟的腎小管上皮細胞失去自身極性,E-cadherin表達下調或消失,細胞間緊密連接被破壞,失去原有上皮細胞表型,上皮細胞黏附特性喪失,腎小管上皮細胞遷移能力增強,從基底膜上脫落,胞漿內細胞骨架重新排列,轉而表達間質細胞表型,如α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮型的角蛋白(cytokeratin,CK)、波形纖維蛋白(Vimentin, Vim)等。肌成纖維細胞(myofibroblast)等腎間質細胞能合成和分泌ECM,其數(shù)量的多少被認為與腎功能進行性惡化相關,并且可作為預測疾病預后的指標之一。 晚期氧化蛋白產物(advanced oxidation protein products, AOPP)是一種新型尿毒毒素,其水平在CKD患者體內增高,并且隨著腎功能的惡化而呈持續(xù)升高趨勢。AOPP是氧化系統(tǒng)對蛋白質產生氧化損傷所形成的交聯(lián)產物,主要成分是被氧化的血清白蛋白,含有雙酪氨酸及羰基官能團,與AGES的結構相似。大量研究結果表明AOPP是氧化應激的產物,具有氧化應激活性,通過引起氧化應激,能導致機體免疫功能紊亂,促使多種疾病的發(fā)生發(fā)展。同時,AOPP也是一種促炎癥反應介質,可以通過單核-巨噬細胞等吞噬細胞的呼吸爆發(fā),介導炎癥因子大量合成、釋放,形成級聯(lián)放大炎癥反應,損傷血管內皮,是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在體外研究中,AOPP能誘導足細胞表型改變,失去E-cadherin等上皮細胞表型特征,下調足細胞特征蛋白nephrin、podocy表達,上調α-SMA等間質細胞表型特征表達,引起蛋白尿；誘導脂肪細胞內炎癥反應及胰島素抵抗,引起代謝綜合征。 氧化應激(Oxidative stress, OS)是細胞內氧化與抗氧化能力的失衡,與多種疾病關系密切。其中,活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)的增多、NADPH氧化酶的活化在氧化應激引起細胞組織氧化損傷過程中發(fā)揮著重要作用。細胞發(fā)生氧化應激時,一方面,導致細胞和分子的功能紊亂,氧化產物不能被抗氧化系統(tǒng)及時清除,產生的大量ROS蓄積在細胞內；導致抗氧化酶的非酶糖基化增多,細胞抗氧化酶活性降低,使得機體的抗氧化能力下降；另一方面,氧化應激時,NADPH氧化酶被活化,細胞膜受損傷后,引起細胞膜液態(tài)流動性和脂質雙分子層結構不穩(wěn)定,導致細胞氧化損傷,生物膜的脂質過氧化,細胞內蛋白和酶變性,造成DNA損傷。此外,蓄積的ROS能促使脂質過氧化,蛋白質硝基化,脂質和蛋白質的氧化產物與受體結合,介導新的氧化應激反應,造成惡性循環(huán)。同時,ROS作為第二信使激活信號轉導級聯(lián)途徑和轉錄因子,導致核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)激活,進一步加劇氧化應激狀態(tài)。增多的ROS激活Src酶,使得維持細胞極性的鈣黏蛋白所連接的p120-catenin酪氨酸磷酸化作用增強并移位,隨后通過Rho/Rho通路破壞細胞間連接。 ROS來源廣泛,多種酶系統(tǒng)均可合成,其中主要包括NADPH氧化酶系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),蛋白尿、高糖條件等多種因素均可誘發(fā)氧化應激,激活腎小管上皮細胞內的NADPH氧化酶系統(tǒng),以NADH作為底物,NADHP提供電子,產生O2-,通過激活PKC、己糖胺、多元醇、AGEs等信號轉導通路,活化腎小管上皮細胞,從而導致ROS合成、分泌增多；大量的ROS產生、蓄積,調節(jié)PKC、絲裂原活化蛋白激酶和各種細胞因子、轉錄因子的表達,導致ECM基因表達上調；同時,激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)進一步加重ROS誘導的腎損傷。另據(jù)研究表明,轉化生長因子β1(transforming growing factor-β1.TGF-β1)等致纖維化因子刺激大鼠腎小管上皮細胞后,細胞內ROS產生增加,同時NADPH氧化酶亞單位表達顯著上調,而給予NADPH氧化酶抑制劑DPI則能阻斷這種現(xiàn)象。 ROS半衰期極短,體外檢測困難。但是,丙二醛(MDA)這種氧化應激過程中產生脂質代謝物,化學性質穩(wěn)定,體外檢測方便,可以作為評價氧化應激的良好指標。此外,此外抗氧化酶超氧化氧歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力也能較好地評價氧化應激的抗氧化能力。 在本實驗中,利用次氯酸氧化BSA制備AOPP,以人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞株)作為靶細胞,給予不同濃度AOPP刺激,通過氧化應激誘導腎小管上皮細胞轉分化,觀察細胞表型蛋白α-SMA、E-cadherin及其對應mRNA表達的變化,并檢測氧化應激指標(MDA含量、SOD活力、CAT活力及GSH-px活力)的變化；并觀察使用NADHP氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD預處理后,AOPP誘導HK-2細胞發(fā)生氧化應激、EMT的變化情況,從而探討AOPP對腎小管上皮細胞EMT的影響及作用機制,為進一步抑制腎小管上皮細胞EMT、防治腎間質纖維化提供新的實驗依據(jù)。 一、研究目的 觀察人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞株)在AOPP刺激后,表型蛋白α-SMA.E-cadherin及其對應mRNA的變化、氧化應激指標的變化；觀察使用NADHP氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD預處理后,AOPP誘導HK-2細胞發(fā)生氧化應激、EMT的變化情況。 二、研究方法 1、AOPP的制備 按1：140的摩爾比例,將無內毒素牛血清白蛋白(BSA)與次氯酸混合,室溫下放置30min,加入PBS透析24h去除殘留的次氯酸,所得樣品用Detoxi-Gel凝膠柱去除內毒素。AOPP含量根據(jù)分光光度計0D340測定。 2、人近端腎小管上皮細胞株HK-2的培養(yǎng) HK-2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育(37℃、5%C02)。觀察細胞長至80%以上融合時,胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板繼續(xù)傳代培養(yǎng),待細胞長至約70%-80%時用于后續(xù)實驗。 3、AOPP對HK-2細胞α-SMA.E-cadherin表達的劑量依賴效應 給予不同濃度AOPP(50、100、200、400μg/ml)與細胞共同孵育24h,50μg/ml BSA作為陰性對照組。收集細胞樣本,分別采用Western blot和Real Time Quantitative PCR(RT-qPCR)檢測α-SMA.E-cadherin的蛋白和mRNA表達量。 4、AOPP對HK-2細胞α-SMA、E-Cadherin表達的時間依賴效應 以200μg/ml AOPP、50μ g/ml BSA與細胞分別孵育不同時間(30min、1h、3h、6h、12h、24h),收集細胞樣本,分別采用Western blot和RT-qPCR檢測α-SMA.E-cadherin的蛋白和mRNA表達. 5、AOPP及抑制劑預處理對HK-2細胞氧化應激的影響 分別用200μg/ml AOPP、50μ g/ml BSA以及以100μ mol/L DPI或200U/m1C-SOD預處理1h后再加入200μ g/ml AOPP刺激細胞。分別孵育30min、1h、24h后收集細胞樣本,制作成細胞勻漿,按各試劑盒所示方法測定并根據(jù)公式計算出丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—px)活力；24h后收集各組細胞樣本采用Western blot和RT-qPCR檢測α-SMA、E-cadherin的蛋白和mRNA表達量。 三、結果 1、AOPP對HK-2細胞α-SMA、E-cadherin表達的劑量依賴效應 與空白對照組及BSA組相比,不同濃度AOPP與細胞共培育可顯著上調α-SMA蛋白表達,下調E-cadherin表達,并且在一定范圍內呈劑量依賴效應。 2、AOPP對HK-2細胞α-SMA、E-cadherin表達的時間依賴效應 與空白對照組及BSA組相比,200μg/ml AOPP刺激細胞30min即可引起E-cadherin蛋白和mRNA表達下調,12h后E-cadherin表達顯著減少；6h后可見α-SMA蛋白表達上調,12h后α-SMA mRNA表達上調,說明AOPP對HK-2細胞α-SMA、E-cadherin表達呈時間依賴效應。 3、AOPP及抑制劑對HK-2細胞氧化應激的影響 與空白對照組及BSA組相比,200μ g/m1AOPP刺激HK-2細胞早期即可引起MDA含量上升,SOD活力、CAT活力及GSH-px活力下降。給予NADPH氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD能部分抑制AOPP誘導的細胞a-SMA表達上調、E-cadherin表達下調,降低MDA含量,提高SOD活力、CAT活力及GSH-px活力。四、結論 AOPP通過氧化應激誘導人近端腎小管上皮細胞EMT,并且存在劑量和時間依賴效應；抑制NADPH氧化酶活性及增加氧自由基清除可以部分抑制腎小管上皮細胞EMT,從而延緩腎間質纖維化的進展。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻】

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本文編號：2495380