【摘要】：研究背景足細(xì)胞是終末分化的臟層上皮細(xì)胞,在維持正常的腎小球?yàn)V過屏障功能當(dāng)中發(fā)揮了重要作用。足細(xì)胞的損傷、脫落和凋亡是糖尿病腎病患者出現(xiàn)蛋白尿的主要原因,最終可進(jìn)展為持續(xù)的腎功能損害。糖尿病腎病常常合并有脂代謝的異常,表現(xiàn)為血清中甘油三酯的升高,其中血清中游離脂肪酸(FFA)水平與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損傷的細(xì)胞器的過程,對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、維持細(xì)胞的正常代謝和存活具有重要意義。研究表明,自噬與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),比如急性腎損傷(AKI),局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS),糖尿病腎病(DN)等其他疾病,而且大量研究表明自噬可以作為糖尿病腎病未來的潛在治療靶點(diǎn),但自噬在脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞凋亡中的具體作用及機(jī)制,還需進(jìn)一步的研究。目的本文擬通過研究棕櫚酸(Palmitic acid,PA)誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬與凋亡,以進(jìn)一步闡明自噬在高脂誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制,旨在探討自噬在脂代謝紊亂導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡中的作用,為臨床治療糖尿病腎病提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法(1)體外培養(yǎng)條件永生性小鼠足細(xì)胞株,待其分化完全后,用不同濃度PA及不同時(shí)間刺激已分化的足細(xì)胞,Western印跡檢測(cè)足細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP-2的表達(dá)。進(jìn)一步采用免疫熒光單丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色觀察PA(150μmol/L)刺激下足細(xì)胞內(nèi)的自噬顆粒的變化。GFP-LC3慢病毒感染足細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定珠,通過PA(150μmol/L)刺激24 h,觀察GFP-LC3熒光顆粒及進(jìn)一步與溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP-2染色共定位檢測(cè)足細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體的變化情況。(2)通過自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,2mmol/L)和氯喹(Chloroquine,CQ,3μmol/L)預(yù)處理足細(xì)胞,采用GFP-LC3免疫熒光及Western印跡檢測(cè)PA(150μmol/L)刺激下足細(xì)胞內(nèi)自噬流的變化。(3)采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC,150μmol/L)預(yù)處理足細(xì)胞,DCFH-DA(10μM)染色觀察PA誘導(dǎo)下足細(xì)胞內(nèi)ROS的變化,進(jìn)一步用GFP-LC3免疫熒光及Western印跡檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)自噬情況。(4)用油紅“O”染色及BODIPY500/510 C1,C12(10μg/ml)染色檢測(cè)PA刺激下足細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)集聚情況,JC-1染色檢測(cè)PA刺激下足細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化情況。(5)采用不同濃度PA刺激足細(xì)胞,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡,Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase3的表達(dá)情況,采用抗氧化劑NAC(150μmol/L)預(yù)處理足細(xì)胞,Western印跡檢測(cè)Cleaved-caspase3的表達(dá)情況。(6)用CQ和雷帕霉素(Rapamycin,Rap,1ng/m L)分別預(yù)處理抑制或促進(jìn)足細(xì)胞自噬,通過PA(150μmol/L)刺激24 h,DCFH-DA染色觀察足細(xì)胞內(nèi)ROS水平,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果(1)與對(duì)照組相比,PA可以呈時(shí)間和濃度依賴性增加足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP-2的表達(dá),PA刺激可以誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬小體及自噬溶酶體的形成增加。(2)自噬抑制劑3-MA可以抑制高脂誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬小體的形成導(dǎo)致GFP-LC3自噬熒光顆粒的形成減少,CQ可以抑制高脂誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬小體的降解導(dǎo)致GFP-LC3自噬熒光顆粒的大量堆積。(3)PA可以增加足細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而抗氧化劑NAC可以減少足細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和減輕自噬。(4)PA可以增加足細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)集聚,線粒體膜電位的下降。(5)PA可以呈濃度依賴性增加足細(xì)胞的凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá),而抗氧化劑NAC可以減少PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。(6)采用自噬抑制劑CQ預(yù)處理足細(xì)胞后,CQ可以進(jìn)一步增加PA誘導(dǎo)下的足細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和加重足細(xì)胞的凋亡,而自噬激活劑Rap預(yù)處理后,Rap可以減少PA誘導(dǎo)下的足細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和減輕足細(xì)胞的凋亡。結(jié)論(1)PA可以誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)集聚、線粒體損傷、自噬的激活和細(xì)胞凋亡。(2)PA誘導(dǎo)的自噬與凋亡主要與足細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS相關(guān),而ROS的產(chǎn)生主要來源于受損傷的線粒體。(3)激活的自噬可清除PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)過量產(chǎn)生的ROS以減少足細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2475298