發(fā)布時(shí)間：2019-04-25 14:41

【摘要】：研究目的 我們?cè)@得一經(jīng)臨床及病理證實(shí)的家族遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（fami-lial focal and segmental glomerulosclerosis, FFSGS）大家系，在國(guó)家自然基金的資助下，對(duì)包括5代共54名成員在內(nèi)的所有人員（未出現(xiàn)腎臟疾病的成員和FFSGS患者）進(jìn)行連鎖分析及全外顯子測(cè)序（與深圳華大基因研究院合作），獲得其致病基因?yàn)镾TRIP1（striatin interacting protein1）。并且經(jīng)過(guò)初步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在膜性腎病大鼠模型PHN、微小病變大鼠模型PAN這些典型足細(xì)胞病動(dòng)物模型中，大鼠腎臟的strip1表達(dá)量增高，并且隨建模時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。 為研究STRIP1是否與足細(xì)胞病變有關(guān)，是否會(huì)通過(guò)影響細(xì)胞形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)導(dǎo)致足細(xì)胞功能的改變，我們以MPC（mouse podocyte clones，小鼠足細(xì)胞克�。┘�(xì)胞系為基礎(chǔ)，探究小鼠野生型Strip1在足細(xì)胞中的功能和突變型Strip1的致病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將從足細(xì)胞形態(tài)、骨架和Strip1相關(guān)蛋白等方面研究Strip1的功能作用機(jī)制，為未來(lái)診斷和治療相關(guān)的足細(xì)胞疾病提供新的思路和依據(jù)。 研究方法 通過(guò)構(gòu)建Strip1基因沉默，野生型過(guò)表達(dá)和突變型過(guò)表達(dá)小鼠腎臟足細(xì)胞模型，研究Strip1在小鼠足細(xì)胞中的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：①針對(duì)小鼠Strip1基因設(shè)計(jì)干擾靶點(diǎn)、合成RNAi序列構(gòu)建干擾腺病毒；②構(gòu)建小鼠Strip1基因野生型和突變型過(guò)表達(dá)腺病毒；③用腺病毒感染完全分化成熟的MPC細(xì)胞，構(gòu)建沉默、野生型和突變型過(guò)表達(dá)等細(xì)胞模型；④通過(guò)細(xì)胞免疫熒光、qPCR和western blotting觀察Strip1基因的功能；⑤通過(guò)細(xì)胞免疫熒光、qPCR和western blotting觀察突變型strip1在小鼠腎臟足細(xì)胞中的作用。 結(jié)果 成功構(gòu)建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型和突變型過(guò)表達(dá)載體腺病毒：①所有構(gòu)建載體（包括RNAi、野生型和突變型）的目的片段序列正確；②試感染MPC細(xì)胞，所有腺病毒均可表達(dá)，效果非常理想（P0.01）；③獲得滴度高達(dá)1011TCID50/ml的三種目的腺病毒。 成功構(gòu)建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型過(guò)表達(dá)足細(xì)胞模型，觀察Strip1對(duì)小鼠足細(xì)胞的作用： 通過(guò)細(xì)胞免疫熒光觀察，①strip1蛋白表達(dá)量降低時(shí)，細(xì)胞形態(tài)改變，邊緣不規(guī)則，足突結(jié)構(gòu)改變，外伸足突伸展不足。F-actin和α-tubulin分布紊亂；②當(dāng)strip1蛋白表達(dá)量顯著增高時(shí)，細(xì)胞變大變圓，邊緣改變，足突結(jié)構(gòu)破壞，偽足樣足突伸展形態(tài)改變。F-actin明顯邊緣化，排列成了一個(gè)又大又圓的球形，邊緣明亮，中間斷續(xù)，α-tubulin完全失去了規(guī)則的排列方式；③Strip1表達(dá)量改變時(shí)，nephrin表達(dá)量變少；④ARP2和CTTNBP2的分布也發(fā)生了改變，部分strip1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞核變大變圓，ARP2在核周的分布形成了一個(gè)不完整的環(huán)形。 通過(guò)western blotting發(fā)現(xiàn)：在完全分化的終末分化MPC細(xì)胞中，①F-actin和α-tubulin表達(dá)量隨strip1變化；②nephrin隨Strip1變化表達(dá)量降低。 通過(guò)Real time PCR發(fā)現(xiàn)：F-actin和α-tubulin mRNA的變化與趨勢(shì)相同（P＜0.05）。 成功構(gòu)建突變型Strip1基因過(guò)表達(dá)足細(xì)胞模型，觀察突變型Strip1對(duì)小鼠足細(xì)胞的作用： 通過(guò)細(xì)胞免疫熒光觀察，①突變的strip1蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，邊緣伸展的足突結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞邊緣明顯不規(guī)則。F-actin和α-tubulin的分布均隨細(xì)胞形態(tài)的改變而化變，F(xiàn)-actin分布更加邊緣化，α-tubulin也失去了正常的排列；②nephrin表達(dá)減少。 通過(guò)western blotting發(fā)現(xiàn)：突變細(xì)胞膜型中，①F-actin表達(dá)量增高；②nephrin表達(dá)量降低。 通過(guò)Real time PCR發(fā)現(xiàn)：F-actin mRNA的變化與趨勢(shì)相同（P＜0.05），Arp2mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05）。 結(jié)論 Strip1影響小鼠腎臟足細(xì)胞的骨架排列，它的異常會(huì)導(dǎo)致肌動(dòng)骨架蛋白F-actin和微管蛋白α-tubulin的分布和表達(dá)異常，細(xì)胞正常形態(tài)消失，足突結(jié)構(gòu)破壞，Strip1可能通過(guò)影響CTTNBP2的蛋白修飾影響細(xì)胞的骨架蛋白排列。且Strip1表達(dá)異常時(shí)，有F-actin支撐固定于裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丟失，從而導(dǎo)致足細(xì)胞功能的損傷。 突變型Strip1影響足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和分布，細(xì)胞形態(tài)改變，足突結(jié)構(gòu)消失，裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丟失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)生突變的Strip1與F-actin相互作用，可能通過(guò)Arp2影響nephrin的表達(dá)。 綜上所述，Strip1基因?qū)S持足細(xì)胞正常形態(tài)和功能起重要作用，改變F-actin分布以致影響骨架分布，結(jié)構(gòu)消失，使裂孔隔膜處錨定nephrin的丟失。該基因的此位點(diǎn)突變可能與足細(xì)胞病發(fā)生有關(guān)，且主要與足突結(jié)構(gòu)消失和nephrin減少相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692.6

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 歐陽(yáng)曉玲;李愛(ài)玲;寧啟蘭;楊旭東;許楠;王慧蓮;;人過(guò)氧化氫酶基因重組腺病毒的構(gòu)建及其酶活性的測(cè)定[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

2 孟憲杰;萬(wàn)毅剛;魏晴雪;陳好利;史喜苗;黃燕如;姚建;;尿毒清顆粒治療慢性腎衰竭研究概況[J];中國(guó)中藥雜志;2013年21期

本文編號(hào)：2465217