【摘要】：背景： 糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家導(dǎo)致終末期腎臟�。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因。蛋白尿和腎小球肥大是DN最重要的兩個(gè)特征。多種機(jī)制包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的激活參與了DN蛋白尿的形成。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中最重要的效應(yīng)分子，研究顯示大部分已知的AngⅡ效應(yīng)是由AngⅡ1型（AngⅡ type1，AT1）受體介導(dǎo)的。大量的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AT1受體拮抗劑（AT1receptor blocker，ARB）可減輕DN腎損傷、降低尿蛋白水平，但其作用機(jī)制目前還不是十分清楚。 脂氧化酶（lipoxygenase，LO）是一類多元不飽和脂肪酸的氧化酶。根據(jù)其氧化花生四烯酸時(shí)氧原子的插入位置不同，可分為5-、8-、12-和15-LO。12-LO以花生四烯酸為基質(zhì)生成12（S）-氫氧化二十碳四烯酸[12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid，12(S)-HETE]。目前已證實(shí)12-LO及其作用產(chǎn)物12(S)-HETE主要通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與DN的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)用AngⅡ刺激腎小球細(xì)胞可激活12-LO活性，且ARB能降低肥胖Zucker大鼠腎組織內(nèi)12-LO活性并延緩蛋白尿進(jìn)展，然而DN時(shí)通過抑制AngⅡ-12-LO作用途徑延緩蛋白尿的機(jī)制尚不完全清楚。 足細(xì)胞構(gòu)成腎小球?yàn)V過的第三道屏障，研究顯示足細(xì)胞數(shù)目減少及裂孔蛋白功能缺陷是DN蛋白尿形成的重要原因。AngⅡ促進(jìn)蛋白尿形成的機(jī)制與足細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達(dá)減少有關(guān)。研究證實(shí)12-LO代謝產(chǎn)物12(S)-HETE亦能減少腎小球內(nèi)P-cadherin表達(dá)。因此，本研究設(shè)想DN時(shí)用ARB阻斷AngⅡ作用，可抑制12-LO活性，進(jìn)而影響足細(xì)胞的EMT過程并上調(diào)nephrin和P-cadherin蛋白表達(dá)，減輕蛋白尿。 胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的重要特征，可通過多種機(jī)制參與DN蛋白尿的形成。研究顯示12-LO參與2型DN時(shí)白蛋白尿的形成，而與1型DN時(shí)白蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系不大。眾所周知，1型和2型糖尿病的重要區(qū)別是IR，因此，我們?cè)O(shè)想12-LO可能通過影響IR作用于蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展。 方法： 1.用10-7mol/L AngⅡ處理足細(xì)胞24h，收集細(xì)胞上清液檢測(cè)12(S)-HETE水平。 2.采用皮下包埋的微型滲透泵給大鼠持續(xù)恒速注入Ang Ⅱ（400ng Kg-1min-1），對(duì)照組大鼠泵注乙醇胺。14天后處死大鼠，提取腎小球，檢測(cè)腎小球內(nèi)12(S)-HETE水平及nephrin和P-cadherin蛋白表達(dá)。 3.采用皮下包埋的微型滲透泵給大鼠持續(xù)恒速注入12(S)-HETE（1mg Kg-1d-1），對(duì)照組大鼠泵注乙醇胺。7天后處死大鼠，提取腎小球，檢測(cè)腎小球內(nèi)AngⅡ水平及nephrin和P-cadherin蛋白表達(dá)。 4.采用高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射的方法誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，模型成功后將大鼠隨機(jī)分為2組：DN組和ARB組（洛沙坦灌胃，5mg Kg-1d-1）。以規(guī)律正常飲食大鼠作為對(duì)照組。6周后處死大鼠，收集24h尿液，提取腎臟，，分離腎小球。過碘酸-希夫氏（periodic acid schiff，PAS）染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)腎小球內(nèi)12(S)-HETE含量，nephrin、P-cadherin、足細(xì)胞上皮型標(biāo)志蛋白及間充質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)。 5.野生型和12-LO基因敲除鼠，分為四組：野生型對(duì)照組（WT），12-LO基因敲除組（LOKO），野生型糖尿病組（WT+STZ）和12-LO基因敲除糖尿病組（LOKO+STZ）。采用一次性腹腔注射大劑量STZ法誘導(dǎo)1型糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠血糖，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前留取24h尿測(cè)尿白蛋白。 6.采用高脂飲食結(jié)合小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病模型，大鼠模型成功后隨機(jī)分為2組：DN組和CDC（cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate，12-LO抑制劑）組（CDC后腿皮下注射，8mg Kg-1d-1，3次/周）。以規(guī)律正常飲食大鼠作為對(duì)照組。8周后處死大鼠，收集24h尿液及血液，并檢測(cè)空腹胰島素水平。 采用系列過篩法分離腎小球，并根據(jù)篩網(wǎng)孔徑將腎小球分為大腎小球（125μm）和小腎小球（75μm）。ELISA檢測(cè)AngⅡ、12(S)-HETE及尿白蛋白水平，放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素水平，Western blot、RT-PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，PAS染色觀察腎組織結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1. AngⅡ直接刺激誘導(dǎo)足細(xì)胞及大鼠腎小球內(nèi)12(S)-HETE含量增加（P0.01）。用微型滲透泵給大鼠皮下注射12(S)-HETE后，大鼠腎小球內(nèi)AngⅡ水平明顯升高（P0.01）。 2. AngⅡ和12(S)-HETE刺激明顯減少大鼠大腎小球內(nèi)nephrin蛋白表達(dá)（P0.05），增加大鼠小腎小球內(nèi)nephrin蛋白表達(dá)（P0.05）。皮下注射AngⅡ和12(S)-HETE后，大鼠大、小腎小球內(nèi)P-cadherin蛋白表達(dá)均減少（P0.05）。 3．與對(duì)照組相比，DN組大鼠血糖、腎重/體重及24h尿白蛋白明顯增加（P0.01），同時(shí)伴有腎小球肥大和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，洛沙坦對(duì)糖尿病大鼠血糖無明顯影響，但明顯降低腎重/體重及尿白蛋白水平（P0.05），減輕腎組織損傷。 4. DN組大鼠腎小球內(nèi)12(S)-HETE水平較對(duì)照組明顯升高（P0.01），洛沙坦治療減少糖尿病大鼠腎小球內(nèi)12(S)-HETE含量（P0.05）。 5.與對(duì)照組相比，DN組大鼠大腎小球內(nèi)nephrin蛋白表達(dá)減少（P0.01），小腎小球內(nèi)nephrin蛋白表達(dá)增加（P0.01），P-cadherin蛋白在大、小腎小球內(nèi)表達(dá)均減少（P0.01）。洛沙坦增加糖尿病大鼠大腎小球內(nèi)nephrin及大小腎小球內(nèi)P-cadherin蛋白表達(dá)（P0.05）。 6.與對(duì)照組相比，DN組大鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞形態(tài)標(biāo)志蛋白緊密連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）和podocin表達(dá)減少（P0.05），而間充質(zhì)標(biāo)志蛋白collagenⅠ、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）和desmin表達(dá)增加（P0.05）。洛沙坦治療后，糖尿病大鼠腎小球內(nèi)足細(xì)胞形態(tài)標(biāo)志蛋白表達(dá)增加（P0.05），而間充質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)減少（P0.05）。 7. LOKO+STZ組小鼠尿白蛋白水平較WT組和LOKO組明顯升高（P0.01），但與WT+STZ組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2型DN組大鼠尿白蛋白水平較對(duì)照組明顯增加（P0.01），CDC治療明顯降低2型糖尿病大鼠的尿白蛋白水平（P0.05）。 8.1型糖尿病模型成功后一個(gè)月內(nèi)，LOKO+STZ組小鼠血糖水平低于WT+STZ組；2型糖尿病模型成功后再給予CDC治療，CDC對(duì)血糖水平影響不明顯。 9.與對(duì)照組相比，2型DN組大鼠空腹胰島素水平明顯升高（P0.01），胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P0.01），CDC治療后，糖尿病大鼠空腹胰島素水平明顯下降（P0.05），胰島素敏感指數(shù)明顯升高（P0.05）。 結(jié)論： 1.2型DN時(shí)AngⅡ和12-LO在腎小球內(nèi)的相互作用可促進(jìn)足細(xì)胞EMT，減少裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達(dá)。 2. ARB可阻斷AngⅡ和12-LO在腎小球內(nèi)的相互作用，進(jìn)而阻止足細(xì)胞的EMT、增加裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達(dá)，延緩蛋白尿進(jìn)展。 3.12-LO可通過IR參與2型DN蛋白尿的發(fā)生與發(fā)展。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 祁佳;肖躍飛;張冬娟;楊光銳;黃海長;;高糖引起小鼠腎小球足細(xì)胞podocalyxin蛋白的表達(dá)下調(diào)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年02期

2 鄔玉芬,顧維正,丁葉鵬,諸芳芳;空腹胰島素放射免疫分析與發(fā)光酶免分析的結(jié)果比較[J];放射免疫學(xué)雜志;2001年02期

本文編號(hào)：2445665